治験薬製品の製造とその品質評価方法の確立を目指した。製造では、培養、遺伝子導入、脂肪組織採取等の方法を最適化した。品質評価では、複数ロットの細胞を用いてGMACの種々の特性パラメータを解析し、品質評価系の構築を進めた。移植する改変FVIII-ヒトGMACと改変VWF-ヒトGMACの適切な配合比を決定し、非臨床安全性及び有効性試験の最適化を進めた。<br />令和4年度から引続き培養方法の検討を進め、製造過程の拡大培養で用いる培地を新規培地に変更した。Oxgene社または自社で作製した改変FVIII及び改変VWF遺伝子搭載レンチウイルスベクターを用い、改変FVIII-ヒトGMAC及び改変VWF-ヒトGMACの調製に問題無い事を確認した。遺伝子導入効率の向上を目的とし、新規補助試薬の併用を検討し、高コピー、高陽性率の改変FVIII-GMACの調製が可能となった。実製造での処置室からセルプロセッシングセンターへの脂肪組織搬入を想定した輸送プロセスの改良を進め、天井培養によるヒト前脂肪細胞の獲得細胞数を指標とした検討により、従来法と比べ獲得細胞数に差異が無い事を確認した。この結果から、今後改良した方法を用いる事とした。<br />複数の健康成人ボランティアから採取した脂肪組織を天井培養し、得られたヒト前脂肪細胞から改変FVIII-ヒトGMAC及び改変VWF-ヒトGMACを調製した。至適化した遺伝子導入条件の下、これらのGMACは細胞ロットに関わらずほぼ同等の特性を示す事を確認した。令和4年度の検討を通じて至適化した移植条件の下、改変FVIII-ヒトGMAC：改変VWF-ヒトGMAC = 1：3の配合比で免疫不全マウスへ移植した。移植後28日に30 %以上、移植後84日において5 %以上と何れも治療域を超えるFVIII血中分泌を達成した。<br />既存培地から新規培地の変更に伴い、不純物試験として新たに3成分を追加した。培地成分の変更が既に確立した試験方法に及ぼす影響を確認し、改変FVIII-ヒトGMAC及び改変VWF-ヒトGMACの特性評価、品質評価について市販ELISAキット等を用いた測定方法を開発した。レンチウイルスベクター残留試験、不純物試験の測定方法を開発した。<br />血友病Aモデルマウスを用いた非臨床薬理試験の実施に向けた事前検討として、改変FVIII-マウスGMAC及び改変VWF-マウスGMACを調製し、野生型マウスへ移植、FVIII血中分泌を評価した。移植後14日に20 %以上のFVIII血中分泌を確認し、血友病Aモデルマウスを用いた血中FVIIIの薬理作用を窺える結果を得た。<br />さらに改変FVIII-GMACの実用化権利の確保のため、国際特許出願（WO2024/106355、優先権主張日2023年11月13日）を行った。