本研究計画では、AGSで同定されているADAR1遺伝子の触媒ドメイン内点変異(K999N)をノックインした(AGS KI)マウスの表現型解析を行い、本マウスがAGS様脳炎などの症状を再現するかを検証する。また、ADAR1遺伝子のZ型RNA結合ドメイン(ZBD)内にもAGS型点変異が見つかっていることから、まだその実体がよくわかっていないZ型RNAを同定し、ADAR1によるZ型RNAへの結合や編集がどのようにAGS病態に関与するかを明らかにすることを最終目標とした。<br />令和3年度までの解析によって、AGS KIマウスがRNA編集活性の低下、MDA5活性化に起因する全身性のISG発現上昇、脳の石灰化沈着や浮腫を呈すことを明らかにし、本マウスが一連のAGS病態を再現できるモデルになり得ると結論付けた。一方、Z型RNAへの結合活性を喪失する点変異をノックインした(W195A KI)マウスは、ISGの著しい発現上昇を伴う成長遅延によって約半数が生後2ヶ月以内に死亡した。また、これらの異常はMDA5を欠損させることによって正常化したため、ADAR1によるZ型RNAへの結合や編集が生じなくなることでMDA5が活性化することが明らかになった。一方、W195A変異によって編集が低下する基質が実際にZ型構造を形成することを可視化するために、ADAR1との複合体の構造解析を試みたが、ADAR1タンパクの精製が難航したため、計画を変更して令和4年度も継続した。加えて、W195A KIマウスを中長期的に観察し、脳の石灰化などの症状が認められるかについても検証し、令和4年度は以下の成果を得た。(1)発現コンストラクトを検討することによってヒトおよびマウスADAR1タンパク質を高純度で調製することに成功した。さらにin vitro転写法によって調製した基質とADAR1タンパク質を混合して、金属グリッド上で瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡を用いて観察を行うことで、予備的な電子顕微鏡画像を取得した。今後はグリッド作成の条件を詳細に検討することによって、ADAR1タンパク質の構造決定を目指す。 (2)6ヶ月齢のW195A KIマウスの脳について組織解析を実施したところ、2ヶ月齢と比較し、グリオーシスの増悪化や軽微な石灰化が認められた。また、脳室が著名に拡大しており、水頭症様の病態を呈すことが明らかになった。