（大木）本年度はマーモセットの複数の視覚関連領野において領野の境界を同定する手法を確立した。まず、低次視覚野である一次・二次視覚野にアデノ随伴ウイルスベクターを用いてGCaMPを導入し、直径7mm程度の光学窓を作成して広域カルシウムイメージングを行った。マーモセットに動く縞模様刺激を呈示したところ、一次・二次視覚野のよく知られた機能構造である方位選択性マップを観察することができた。次に、一次視覚野と二次視覚野の境界を調べるために視野の水平方向のレチノトピー構造を調べた。視覚刺激として、モニタ上の限られた領域に縞模様刺激を呈示した（視野角にして幅0.5度・高さ10度の限られた範囲に縞模様刺激を呈示した。この刺激を水平方向に異なる10か所の位置に順番に呈示し、それぞれの刺激位置に対応する応答を調べた）。その結果、一次視覚野と二次視覚野の両方で視覚刺激の位置特異的な応答が観察され、水平方向のレチノトピー構造を可視化することに成功した。同様の視覚刺激を用いて垂直方向のレチノトピー構造も可視化することができた。一次・二次視覚野の水平方向のレチノトピー構造に着目すると、視野中央の垂直軸において一次視覚野と二次視覚野のレチノトピーの勾配が反転する様子が観察され、このことから、レチノトピー構造を用いて一次視覚野と二次視覚野の領野境界を同定することが可能になった。低次視覚野で開発したレチノトピーを用いた領野境界決定法を高次視覚野に拡張するため、次に、高次視覚野であるMT/MST野において同様の実験を実施した。MT/MST野の神経細胞は刺激の運動方向選択性を有するため、ドットモーション刺激を用いて視覚応答を調べたところ、方向選択性マップを観察することができた。次に、ドットモーション刺激を視野の限られた場所に呈示することでMT/MST野レチノトピー構造を調べたところ、偏心度（eccentricity）と方位角（azimuth）のレチノトピー構造を可視化することに成功した。特に偏心度のレチノトピーを用いてMT野とMST野の領野境界を、方位角のレチノトピーを用いてMT野とMTc野の領野境界を決定することができた。これらの研究結果から、マーモセットの低次・高次視覚野両方において、レチノトピー構造を用いた領野境界決定方法を確立することができた。
（黒滝）本年度は、割球分離法と受精卵クローン法のどちらがマーモセットの一卵性双生児の作出効率が高いかについての条件検討を行った。割球分離胚については、7～16細胞期の受精胚を1～4割球で構成される複数の胚に分離し、分離した胚はそれぞれ不要な卵子から得られた透明帯の中に挿入し、胚盤胞期まで培養した。透明帯の準備はピエゾによって穴を開ける方法と、ガラスナイフでスリットを作製する手法を検討し、ピエゾでの作業効率が良好だったためピエゾ法で統一した。14胚を用いて１～４割球で構成された胚を培養したところ、1割球(n=27)、2割球(n=12)、3割球(n=21)、4割球(n=14)からそれぞれ56%(n=15), 83%(n=10), 67%(n=14), 93% (n=13)の効率で胚盤胞に発生したことから、割球数が増加するに従って胚盤胞に発生しやすい傾向にあることが明らかとなった。また、それらの14胚から、総計71胚の割球分離胚を用意し、そのうち54胚が胚盤胞に発生したことから、1つの受精胚から平均で3.8個の胚盤胞を得ることができた。14胚中13胚から2個以上の胚盤胞が得られ、遺伝的に同一な胚盤胞のセットを得る効率はマイルストーン値50%を上回る93%だった。
割球分離法と別途実施した受精卵クローン法における遺伝的に同一な胚盤胞のセット（2胚以上）を得る条件（遺伝的に同一なセットを準備したうち胚盤胞に2胚以上が発生する率）は、割球分離法の場合93％、受精卵クローン法の場合100％となり、いずれの方法でも目的の50%より高い効率で得ることに成功した。受精卵クローンについてはn数が少ないため、追加検証をする必要がある。一方で、それぞれの方法で得られた胚を子宮へと胚移植した場合に出生に至る効率は不明であるため、今後胚移植を行うことでより効率の高い最適な手法を選択し、来年度以降の実験に適用していく予定である。
（的場）本年度は、割球分離法と受精卵クローン法のどちらがマーモセットの一卵性双生児の作出効率が高いかについての条件検討を行った。受精卵クローンについて、12-16細胞期の受精胚の割球について酵素を用いてバラバラにして、それぞれの単一割球をあらかじめ核を取り除いておいたレシピエント卵子に融合させて作製した。ドナー細胞を融合させる際に細胞周期調整のために用いるサイトカラシンDの培養タイミングを検討した結果、細胞融合前群(CCD-B)、細胞融合後群(CCD-A)、CCD処理無群(w/o CCD)の3群で、使用レシピエント卵子数13個、6個、4個、融合成功胚数8個、1個、4個、そのうち胚盤胞到達数は2個(15.4%)、1個(16.7%)、4個(100%)であり、細胞周期を調整する薬剤の使用は不要であることが明らかとなった。最適条件では、1つの受精胚から4個の胚盤胞を得ることができたため、n数は少ないものの遺伝的に同一な胚盤胞のセットを得る効率ははマイルストーン値50%を上回る100%となった。
受精卵クローン法と別途実施した割球分離法における遺伝的に同一な胚盤胞のセットを得る条件は93％となり、いずれの方法でも目的の50%より高い効率で得ることに成功した。受精卵クローンについてはn数が少ないため、追加検証をする必要がある。一方で、それぞれの方法で得られた胚を子宮へと胚移植した場合に出生に至る効率は不明であるため、今後胚移植を行うことでより効率の高い最適な手法を選択し、来年度以降の実験に適用していく予定である。