SA1. シナプスエングラムの可視化
LTPを起こしたシナプスにコフィリンが濃縮されることを指標にLTPを起こしたシナプスを同定することを試みる。Cre依存的にコフィリンの遺伝子座に組換を起こし、GFP融合タンパク質を発現するノックイン動物を作成した。Creを一部の神経細胞にのみ発現させることで、その細胞でのみcofilin-GFPが発現すると期待される。グルタミン酸の脱ケージ化によりLTPを誘導したところ、cofilin-GFPが樹状突起スパインに移行していく像が観察された。これはこれまで過剰発現したcofilin-GFPで観察された現象がノックインされたcofilin-GFP動物でも観察できるということとなり、期待された通り、生動物でのLTPの検出が可能であることを示唆している。
SA2. シナプスエングラムの操作
CaMKIIのリンカー領域の長さの操作を通してLLPSを操作する方法を開発している。リンカー領域に光照射によりヘテロ二量体形成を解消するLOV2-Zdkを利用したリンカーを挿入し、光照射によりリンカー長が伸長するOptoLinker-CaMKII分子を構築した。培養細胞を用いたLLPS形成システムにOptoLinker-CaMKIIを適用したが、LLPSの解消には至っていない。リンカーのアミノ酸の電荷および疎水性がLLPS傾向を決定づけるより本質的な因子であるという報告も最近有り、リンカーのアミノ酸組成についても検討している。また、CaMKIIのキナーゼドメインとハブドメインをTEVプロテアーゼで切断することでLLPSを解消する方法を開発中である。
SA3.エングラム細胞間に形成されたシナプスの操作法
シナプスエングラムの標識操作を目的に、HEK293細胞を使ったシナプス前GRASPとシナプス後GRASP構築の条件を検討している。特に発現方法、蛍光タンパク質の再構成が起こる時間の条件検討を行っている。既存のシナプス標識技術であるeGRASP法を応用し、可視化目的の蛍光タンパク質と光操作用蛍光タンパク質SuperNovaを入れ替えた遺伝子構築を作成した。また、光操作条件検討用構築としてSuperNovaと黄色蛍光をそれぞれGRASPに組み込んだ遺伝子構築を作成した。発現条件が最適化されていないため、光刺激条件の検討には至っていない。