本年度は、脳内の情報処理および病態形成に深く関与するアストロサイトにおける細胞内シグナルの空間的かつ分子的動態を解析することを目的とし、新規のシグナル依存的プロテオーム技術の開発に取り組んだ。特に、細胞内セカンドメッセンジャーとして重要なカルシウムおよびcAMPに着目し、これらのシグナルに応答して標的分子の同定を可能とするCaMP-ID法およびcAMPin-ID法の構築および機能評価を行った。
CaMP-ID法は、酵素活性の再構成型ビオチン化酵素であるSplit-TurboID技術を基盤とし、カルシウム依存的に酵素活性が誘導されるよう設計されたプロテオームツールである。具体的には、cpUltraIDまたはcpTurboIDのN末端およびC末端断片に、カルモジュリン（CaM）およびその結合パートナーであるM13ペプチドをそれぞれ融合させ、カルシウム結合によって両断片が再会合し、酵素活性が再構成されるシステムを構築した。その結果、cpUltraID誘導体では有意なビオチン標識は確認されなかったが、cpTurboID誘導体ではカルシウム添加によりビオチン標識の増加が培養アストロサイトにおいて観察された。ただし同時に、カルシウム非依存的なバックグラウンド標識も検出され、シグナル特異性の確保という点においては、今後さらなる最適化が必要であることが示唆された。一方、cAMPin-ID法においては、当初の技術設計を超える成果が得られた。本法は、cAMP応答性のPKA由来センサー領域を用いて、cAMPシグナル依存的にcpTurboIDを活性化させる設計に基づいている。さらに本年度の開発では、従来設計には存在しなかったcpEGFPを融合する拡張設計を導入した。この改良により、本ツールはcAMP応答に基づく標的タンパク質のビオチン標識に加え、cAMP濃度の空間的変化をリアルタイムで可視化できる蛍光センサー機能をも併せ持つ、可視化可能な空間プロテオーム解析ツールとしての機能を実現した。実際に、培養細胞を用いた検証において、アデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリンを添加した結果、EGFP蛍光の強度がcAMP依存的に上昇し、これと並行してビオチン標識の顕著な増加も確認された。これらの成果は、cAMPin-ID法が空間情報と分子情報の同時計測を可能とするツールであることを示しており、cAMP応答性シグナルの高解像度マッピングと機能的プロテオーム解析の両立という点で、当初想定を大きく上回る技術的成果であった。