ベトナム北部において感染伝播する薬剤耐性結核菌クラスター株の拡大要因の解明
研究課題情報
- 課題管理番号
- 25wm0225028h0003
- 統合プロジェクト(三期)
感染症プロジェクト
- 統合プロジェクト(二期)
疾患基礎研究プロジェクト<第二期>
- 事業名
新興・再興感染症研究基盤創生事業
- タグ(2025)
研究開発目的: 予防・保健に関する研究
研究の性格: 基礎的研究<シーズ・コンセプト検討等>
ICD-10大分類: 感染症および寄生虫症
対象疾患領域: 感染症
特記的事項: 国際共同研究 , 病原体の研究 , AMR
補足確認: 診断 , 治療
- タグ(2024)
研究開発目的: 予防・保健に関する研究
研究の性格: 基礎的研究<シーズ・コンセプト検討等>
ICD-10大分類: 感染症および寄生虫症
対象疾患領域: 感染症
特記的事項: 国際共同研究 , 病原体の研究 , AMR
補足確認: 予防・保健 , 診断 , 治療
- タグ(2023)
研究開発目的: 予防・保健に関する研究
研究の性格: 基礎的研究<シーズ・コンセプト検討等>
ICD-10大分類: 感染症および寄生虫症
対象疾患領域: 感染症
特記的事項: 国際共同研究 , 病原体の研究 , AMR
補足確認: 予防・保健 , 診断 , 治療
- 代表研究機関
- 公益財団法人結核予防会結核研究所
- 研究代表者
(2025) 慶長直人, 公益財団法人結核予防会結核研究所, 副所長
(2024) 慶長直人, 公益財団法人結核予防会結核研究所, 副所長
(2023) 慶長直人, 公益財団法人結核予防会結核研究所, 副所長
- 研究期間
- 2023年度 - 2025年度
- 課題への総配分額
- 58,500 千円
- 研究概要(2025)
- 慶長:ハノイ結核菌臨床分離株より得られる各種結核菌ゲノム変異、遺伝的クラスターの有無を指標とした伝播性の高低に加えて、現地から得られる臨床疫学情報を含めて関連解析を行い、薬剤耐性株の拡大を抑制するための標的を明らかにする。IS6110以外の結核菌ゲノムへの挿入配列および拡大Gクラスタに関連する候補遺伝子についても統合解析する。 土方:1,2年度目に得られた拡大する亜群に関連する候補遺伝子の発現と一般的に結核マーカーとされる遺伝子の発現の関連を網羅発現解析とqRT-PCR発現量解析を組み合わせて検討し、臨床疫学情報とあわせて結核菌の拡大に関わる宿主要因を明らかにする。 瀬戸:結核マウスモデルにおける菌遺伝子発現プロファイルおよび生存に関与する菌遺伝子から、拡大伝播するクラスター株における生体内での適応度に関与する遺伝子の探索を行う。結核発症バイオマーカーの新規探索のため、臨床分離株感染マウス感染肺、血液中に含まれる脂質を抽出して、網羅的脂質同定解析を行う。
- 研究概要(2024)
- 慶長:ハノイ市のコホート研究において、結核菌の薬剤耐性変異による増殖力低下を補う代償性変異、増殖力回復変異、菌ゲノムのメチル化に注目して、薬剤耐性株の伝播拡大に関わる病原因子を明らかにする。また10年間で明らかな感染伝播の広がりが証明されている菌群(拡大Gクラスター株)に焦点を当て、その他の菌群との比較を通じて疫学的要因を検討する。さらに結核菌ゲノム挿入配列の中で最も重要とされるIS6110のコピー数と挿入位置を分析し、拡大Gクラスターとの関連性を明らかにする。 土方:ハノイ市で拡大する薬剤耐性を有するL2結核菌亜群感染患者の全血液mRNA発現の特徴を明らかにするために、初年度の網羅発現解析結果から候補遺伝子を選別し、結核菌分離株と全血液の提供がある全症例を用いて、qRT-PCRにより発現量を測定する。ハノイで拡大する結核菌に関連する宿主応答遺伝子の絞り込みを行う。 瀬戸:結核菌臨床分離株のトランスポゾン変異株ライブラリーを作成して、トランスポゾンシークエンスを行い、臨床分離株間での遺伝子要求性を明らかにした。今年度は、これらの臨床分離株をヒト結核マウスモデルであるC3HeB/FeJに感染させて、肺内生存に関与する遺伝子要求性を明らかにすることで、生体内における適応度を決定する遺伝因子を同定することができる。
- 研究概要(2023)
- 慶長:ハノイ市のコホート研究における臨床情報、疫学情報と結核菌臨床分離株を用いて、薬剤耐性変異による結核菌の増殖力低下を補う代償性変異のほか、増殖力回復変異、菌ゲノムのメチル化に着目し、薬剤耐性株の伝播拡大に寄与する病原因子の一端を明らかにする。土方:ベトナム ハノイ市で拡大する薬剤耐性を有するL2結核菌亜群感染患者の全血液mRNA発現の特徴を明らかにするために、ハノイ市の結核患者から、この亜群が分離された結核患者群、対照症例群を選択し、イルミナシークエンサーを用いてmRNA網羅発現差解析を実施する。瀬戸:拡大Gクラスターの生体内での適応度を評価するため、ヒト結核菌感染マウスモデルにおいてRNA-seqやTn-seq、lipidomeなどオミックス解析を用いて、菌の生体内での増殖に関与する遺伝子と脂質の同定を行う。今年度は臨床分離株の生体内での菌RNA発現解析およびトランスポゾン変異株ライブラリー作成を行う。
研究成果情報
2024
2023
成果の概要
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ハノイの代表的な結核菌臨床分離株の主なメチル化パターンはCTCCAG/CTGGAG(m6A)であり、メチル化の欠如は、第2系統(L2北京型)およびハノイ市でまん延する拡大Gクラスター株双方に認められた。
拡大するGクラスター株は、有意にハノイ市の都市部で認められ、薬剤耐性変異の保有率が高く、系統樹の終末枝が有意に短く、最近の感染伝播を示唆した。完全長配列より、コーディング配列予測プログラムを用いてIS6110配列の有無により得られるコーディング領域のちがいを比較検討した。さらに精度向上のための検討を進めている。(慶長)
結核菌ゲノム解析結果と臨床疫学情報を伴う結核患者全血液パネル(417検体)を用いてRT-qPCRにより遺伝子発現量を測定した。測定に用いるエクソン接合部は長鎖シークエンサーによるmRNA配列解析から選定した。結核菌に特有な糖脂質を認識するCLEC4E遺伝子の低発現が、宿主CLEC4Eバリアント遺伝子型、結核菌薬剤耐性とは独立して、ハノイで拡大する祖先型亜群と関連しており、拡大との関連が示唆された。(土方)
昨年度構築した結核菌臨床分離株のトランスポゾン変異株ライブラリーからGクラスター株をC3HeB/FeJマウスに感染させた。感染21日目までに感染肺を回収して、感染肺を培養して回収して結核菌DNAを用いて、Tn-seqを行った。Tn-seqの結果からGクラスターにおいて生体内での生存に必須な遺伝子を同定している。(瀬戸)
ハノイ地区で分離された結核菌で最大クラスターを形成したGグループ株の割合が、10年経過することで約2倍に増大した。Gクラスター結核菌の非同義置換多型が存在する遺伝子の中で、特に細胞壁合成に関与する酵素に注目し遺伝子破壊株を作製した。本年度は、4種類の遺伝子の内、2遺伝子(Rv2946とRv2959相当)は遺伝子破壊変異株を分離できた。細胞壁構造等の変化を分析中である。(前田)
コホート研究のL1, L2, L4クラスター臨床分離株30株から総脂質画分を抽出し、薄層クロマトグラフィーで網羅的に脂質解析した。L1, L4と異なるパターンで発現するスポットをL2クラスターに認めた。各種カラムクロマト、溶媒沈澱法を駆使してL2クラスターの特徴的なスポットを精製純化した。フェノール糖脂質の構成成分であるフチオセラン酸、ジマイコセロセートにフォーカスを当て、MALDI-TOF/MSによる質量分析から推定構造を解析中である。L2クラスターのembR2遺伝子欠損との関連が示唆され、主要脂質分子の表現型とコホート分析を紐付ける結果であった。(藤原)
拡大するGクラスター株は、有意にハノイ市の都市部で認められ、薬剤耐性変異の保有率が高く、系統樹の終末枝が有意に短く、最近の感染伝播を示唆した。完全長配列より、コーディング配列予測プログラムを用いてIS6110配列の有無により得られるコーディング領域のちがいを比較検討した。さらに精度向上のための検討を進めている。(慶長)
結核菌ゲノム解析結果と臨床疫学情報を伴う結核患者全血液パネル(417検体)を用いてRT-qPCRにより遺伝子発現量を測定した。測定に用いるエクソン接合部は長鎖シークエンサーによるmRNA配列解析から選定した。結核菌に特有な糖脂質を認識するCLEC4E遺伝子の低発現が、宿主CLEC4Eバリアント遺伝子型、結核菌薬剤耐性とは独立して、ハノイで拡大する祖先型亜群と関連しており、拡大との関連が示唆された。(土方)
昨年度構築した結核菌臨床分離株のトランスポゾン変異株ライブラリーからGクラスター株をC3HeB/FeJマウスに感染させた。感染21日目までに感染肺を回収して、感染肺を培養して回収して結核菌DNAを用いて、Tn-seqを行った。Tn-seqの結果からGクラスターにおいて生体内での生存に必須な遺伝子を同定している。(瀬戸)
ハノイ地区で分離された結核菌で最大クラスターを形成したGグループ株の割合が、10年経過することで約2倍に増大した。Gクラスター結核菌の非同義置換多型が存在する遺伝子の中で、特に細胞壁合成に関与する酵素に注目し遺伝子破壊株を作製した。本年度は、4種類の遺伝子の内、2遺伝子(Rv2946とRv2959相当)は遺伝子破壊変異株を分離できた。細胞壁構造等の変化を分析中である。(前田)
コホート研究のL1, L2, L4クラスター臨床分離株30株から総脂質画分を抽出し、薄層クロマトグラフィーで網羅的に脂質解析した。L1, L4と異なるパターンで発現するスポットをL2クラスターに認めた。各種カラムクロマト、溶媒沈澱法を駆使してL2クラスターの特徴的なスポットを精製純化した。フェノール糖脂質の構成成分であるフチオセラン酸、ジマイコセロセートにフォーカスを当て、MALDI-TOF/MSによる質量分析から推定構造を解析中である。L2クラスターのembR2遺伝子欠損との関連が示唆され、主要脂質分子の表現型とコホート分析を紐付ける結果であった。(藤原)
学会誌・雑誌等における論文一覧
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1. Ito M, Morimoto K, Ohashi M, Wakabayashi K, Miyabayashi A, Yamada H, Hijikata M, Keicho N. Primary Ciliary Dyskinesia Due to Compound Heterozygous Variants in CFAP221 with Obstructive Azoospermia: Young's Syndrome May Be a Phenotype of Primary Ciliary Dyskinesia. Intern Med. 2025 Feb 1;64(3):423-428. doi: 10.2169/internalmedicine.3978-24.
2. Nakamura H, Hikichi H, Seto S, Hijikata M, Keicho N. Transcriptional regulators SP110 and SP140 modulate inflammatory response genes in Mycobacterium tuberculosis-infected human macrophages. Microbiol Spectr. 2024 Oct 3;12(10):e0010124. doi: 10.1128/spectrum.00101-24.
3. Ito M, Morimoto K, Saotome M, Miyabayashi A, Wakabayashi K, Yamada H, Hijikata M, Keicho N, Ohta K. Primary Ciliary Dyskinesia Caused by Homozygous DNAAF1 Mutations Resulting from a Consanguineous Marriage: A Case Report from Japan. Intern Med. 2024 Oct 15;63(20):2847-2851. doi: 10.2169/internalmedicine.3263-23.
4. Hijikata M, Morimoto K, Ito M, Wakabayashi K, Miyabayashi A, Yamada H, Keicho N. Genetic Variants Supporting the Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia in Japan. Clin Genet. 2025 Feb;107(2):219-223. doi: 10.1111/cge.14640.
5. Hijikata M, Morimoto K, Ito M, Wakabayashi K, Miyabayashi A, Keicho N. Robust detection of pathogenic HYDIN variants that cause primary ciliary dyskinesia using RNA-seq of nasal mucosa. J Med Genet. 2025 Feb 26;62(3):180-184. doi: 10.1136/jmg-2024-110400.
6. Sakai Y, Asa M, Hirose M, Kusuhara W, Fujiwara N, Tamashima H, Ikazaki T, Oka S, Kuraba K, Tanaka K, Yoshiyama T, Nagae M, Hoshino Y, Motooka D, Rhijn I V, Lu X, Ishikawa E, Moody D B, Kato T, Inuki S, Hirai G, Yamasaki S. A conserved human CD4+ T cell subset recognizing the mycobacterial adjuvant, trehalose monomycolate. J Clin Invest. 2024, Dec 24;135(6):e185443. doi: 10.1172/JCI185443.
学会・シンポジウム等における口頭・ポスター
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1. 原発性線毛機能不全症候群, 慶長直人,土美奈子,伊藤優志,森本耕三, 第99回日本結核・非結核性抗酸菌症学会 学術講演会,2024/5/31, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
2. ベトナム人新規活動性肺結核患者におけるIFNAR2遺伝子バリアントの遺伝子型と結核の関連, 土方美奈子,若林佳子,宮林亜希子,瀬戸真太郎,慶長直人, 第99回日本結核・非結核性抗酸菌症学会 学術講演会,2024/6/1, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
3. ベトナム人新規活動性肺結核患者におけるCLEC4E 遺伝子バリアントの遺伝子型と結 核菌遺伝系統の関連, 宮林亜希子,土方美奈子,若林佳子,瀬戸真太郎,前田伸司,慶長直人, 第99回日本結核・非結核性抗酸菌症学会 学術講演会,2024/6/1, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
4. 結核菌感染マウスにおける乾酪壊死を伴う肉芽腫の単細胞RNA シークエンス, 瀬戸真太郎, 大森志保, 中村 創, 引地遥香, 土方美奈子, 慶長直人, 第99回日本結核・非結核性抗酸菌症学会 学術講演会,2024/6/1, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
5. 結核感受性に関与する転写因子MafB による肉芽腫形成制御, 引地遥香, 中村創, 大森志保, 瀬戸真太郎, 土方美奈子, 慶長直人, 第99回日本結核・非結核性抗酸菌症学会 学術講演会,2024/6/1, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
6. Tuberculosis relapse and reinfection among patients with treatment history in Hanoi, Vietnam, Hang NTL, M Hijikata, S. Maeda, Thuong PH , Huan HV, Hoang NP, S Seto, N Keicho, The Union World Conference on Lung Health 2024, TBScience E-Posters, 2024/11, 国外.ポスター.
国外 / ポスター
7. Primary ciliary dyskinesia in Japan, Keicho N, Morimoto K, Ito M, Wakabayashi K, Miyabayashi A. U.S.-Japan Cooperative Medical Sciences Program (USJCMSP) 25th International Conference on Emerging Infectious Diseases (EID) in the Pacific Rim, 2025/3/15, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
8. Recent expansion of Ancient Beijing strain subgroup of Mycobacterium tuberculosis in Hanoi, Vietnam, Hijikata M, Hang NTL, Maeda S, Thuong PH, Hoang VH, Hoang NP, Tam DB, Anh PT, Cuong VC, Wakabayashi K, Miyabayashi A, Seto S, Keicho N, U.S.-Japan Cooperative Medical Sciences Program (USJCMSP) 25th International Conference on Emerging Infectious Diseases (EID) in the Pacific Rim, 2025/3/16, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
9. Single-cell RNA sequencing analysis of mycobacterial necrotic granulomatous lesions, Seto S, Hijikata M, Keicho N. U.S.-Japan Cooperative Medical Sciences Program (USJCMSP) 25th International Conference on Emerging Infectious Diseases (EID) in the Pacific Rim, 2025/3/17, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
10. The biosynthesis of cell surface glycopeptidolipid in nontuberculous mycobacteria, Fujiwara N, Nakaya M, Naka T, Maeda S, 18th Congress of the International Union of Microbiological Societies (IUMS2024). 2024/10/23-25, 国外, ポスター.
国外 / ポスター