本実験調査では、mTORC2選択的な機能阻害作用を有する低分子化合物の取得を目標とする。そこで、mTORC2を構成する分子間の相互作用を検出できる簡便かつ精度の高い系の構築を行った。既知のmTORC2構造解析の情報をもとにタンパク質間相互作用に関わる配列を推定し、Fluoppi法あるいはNanoBiT/NanoBRET法といった蛍光・発光によるタンパク質間相互作用検出法の構築を目指してきた。
令和6年度は、複合体形成によりシグナル増強が明確なNanoBRET法を中心に行った。具体的には、タンパク質Xとタンパク質YにそれぞれBRETエネルギードナーであるNanoLucとエネルギーアクセプターであるHaloTagタンパク質を導入し、複合体形成により生じたBRETシグナルを指標に評価を行った。検討の結果、HEK293細胞にNluc標識タンパク質XとHalo標識タンパク質Yを発現することにより、618リガンド添加によりおよそ5倍のBRETシグナルが見られた。タンパク質Zのdominant-negative変異体共発現により、シグナル減少が見られたことから、本NanoBRET系がmTORC2相互作用を検出していることを検証した。
さらに、mTORC2分子間相互作用阻害のがん細胞増殖抑制に対する作用についてコンセプト検証を行った。タンパク質Zのドミナントネガティブ変異体の誘導発現系をmTORC2活性の高い大腸がん細胞に導入したところ、ドキシサイクリン添加による誘導発現によってin vitroおよびin vivo共に顕著な増殖抑制が認められた。このことから形成した腫瘍に対してもmTORC2の形成阻害によって腫瘍形成抑制作用がみられることを検証した。