本研究課題は、インフルエンザワクチンの品質管理試験におけるパンデミック対応に向けて、試薬の準備に多大な時間が必要な現行の力価試験（SRD試験）の課題を解決するために、(1)同位体希釈質量分析法(ID-MS)を用いて、HA蛋白質の迅速定量系をウイルスHA亜型網羅的に確立し、新型インフルエンザの発生に備えた試験法の樹立を目指す。また(2)クロスリンキング質量分析法（XL-MS）を活用して、ワクチンのHA抗原部位の立体構造評価およびSRD力価との相関性検討を行い、HA抗原の生物学的活性も反映した新規力価法の基盤技術開発を目指す。
課題全体の成果として、ID-MS法では、インフルエンザウイルスの公開データベースから、各HA亜型内で保存性の高い複数の新規標的候補ペプチドを選定するアルゴリズム基盤を構築し、選定した候補ペプチドの有用性について合成ペプチドを用いてID-MSで検証した。その結果、既報のペプチドよりも高感度に検出可能で十分な定量精度を満たす複数の標的候補ペプチドを見出した。また、XL-MS法では、架橋剤物性を考慮してAH5ウイルス株の標的架橋ペプチド候補をin silico解析により予測した。当該ウイルス株HA蛋白質を架橋しXL-MSを行った結果、予測以上の複数の架橋ペプチドを検出した。
担当分では、XL-MS法の基盤技術開発に向け、in silico解析により、標的となる架橋ペプチドの事前予測を行い、分子間・分子内架橋の推定を試みた。今年度は、パンデミック対応ワクチンの元となったH5N1ウイルス株(A/Indonesia/5/2005 (EPI116487))のHA蛋白質配列から、Multi cleavage site（RESRRKKR）をTETRに置換した配列を用いて、AlphaFold3による立体構造予測を行い、作成された予測モデルを用いてPyMolでの架橋ペプチドマッピングを実施した。本研究で使用する架橋剤のアーム長を考慮し、距離12.5Å以内で近接するリジン残基を対象とした結果、XL-MSで測定可能な架橋ペプチド候補として、分子間4種類、分子内6種類を見出した。また、別担当者の上記ウイルス株のrHA発現系構築用ベクターについても同様の解析を行い、ベクター用アミノ酸付加配列が付加された場合においても立体構造が維持され、同様の架橋ペプチドが予測されることを確認した。