研究開発代表者の成果
工藤由起子は、キックオフミーティングを開催し、研究班全体の進め方を確認し、また、日本薬局方原案検討委員会マイコプラズマ否定試験検討WG（座長：石井明子）と情報を共有した。さらに、製薬企業の協会を通して製薬企業へのアンケート調査（マイコプラズマ否定試験の技術的な問題点・課題に関するアンケート）を実施し、試験の現状、問題点、課題などを取りまとめた。加えて、追加予算配分によって、研究開発分担者の課題であるA法で検討する培地成分によるC法での遺伝子増幅に対する影響を検討した。研究開発期間を通じて、研究分担者の研究の方向性と進捗について確認し、統括を行った。
研究開発分担者の成果
林原絵美子は、A法についてEP/USPに記載されている培地と生物基に記載されている培地について、寒天培地の同等性の検証を開始した。気相は嫌気、微好気、CO₂ 5%、好気の4条件で比較したところ、一部の菌種で気相条件の違いはコロニーの大きさやCFUに有意な影響を与えることが示された。CFUを評価項目とした場合、微好気培養を行うことによりEP/USPに記載の培地と生物基に記載の培地の同等性が示された。現在、液体培地についての比較を進めている。
小原有弘は、B法における指標細胞や試験条件の最適化に関する妥当性検証行った。その結果、JCRB0111：VEROが最も安定した結果を示し、指標細胞として最適であると確認された。さらに、試験試料中の培地・添加物が細胞状態に与える影響を評価し、sf-900IISFMやLeibovitz’s L-15では細胞傷害性が認められた。また、抗生物質では高濃度アンホテリシンB、G-418、ピューロマイシンが影響因子となり得ることが判明した。
林克彦は、核酸増幅法（C法）について陽性対照の調製法を検討した。陽性対照には生菌数の割合が高く菌体が分散したマイコプラズマの培養液が使われるが、12菌種のマイコプラズマについて培養法・培養時間を検討して生菌数が高い培養液を得る条件を確立した。また、ナイロン製フィルターによって菌体を分散する方法を確立した。さらに、陽性対照として使用するための不活化（殺菌）マイコプラズマの調製法を加熱によって検討し、適切な陽性対照が得られる加熱温度と時間を確立した。