我々は、Human mannose receptor 1 (hMRC1)がHIV-1エンベロープ糖タンパク質(Env)非依存的にHIV-1粒子放出を抑制していることを明らかにしてきた。
そこで、初年度は、Envタンパク質非依存的にhMRC1と共にHIV-1粒子内に取り込まれる宿主因子を網羅的に探索・同定することを目的とした。
現在までに、ウイルス粒子内タンパク質を二次元電気泳動により分離し、質量分析によって同定するための実験系を確立することに成功している。
具体的には、内在性hMRC1が発現していない293T細胞を用いて、 hMRC1存在・非存在下にて放出されたHIV-1 Env 欠損ウイルス粒子を、ショ糖密度勾配法により濃縮・精製した。その後、二次元電気泳動により粒子内タンパク質を分離し、hMRC1存在下にのみ検出される画分から質量分析をおこない、候補因子の探索をおこなった。
まず、精製したウイルス粒子を用いて、ウエスタンブロット法により既報のCyclophilinA（CypA）がHIV-1粒子内に取り込まれていることを確認した。
次に、二次元電気泳動に使用するウイルス量を検討した。精製後の粒子を等電点電気泳動のサンプルバッファーで溶解後、抽出液の一部を用いてp24量をELISAにて定量し、1.0μg相当量をサンプル量として設定した。また、ウイルス粒子と密度が近いマイクロベジクルであるCD45は粒子内にほとんど検出されないことを確認し、精製粒子の純度が高いことを確認した。更に、分離性能を向上させるために、等電点電気泳動におけるpHレンジを検討した結果、pH3-8の条件で明瞭なタンパク質スポットが得られた。二次元電気泳動後、銀染色をおこない、得られた複数のスポットを切り出して質量分析をおこなった結果、既にHIV-1粒子内に取り込まれることが報告されている宿主タンパク質が同定された。以上より、HIV-1粒子内に取り込まれる宿主タンパク質を同定する方法として妥当な実験系が確立されたと考えられる。