・MASLDに対するクエン酸回路調整化合物補充療法のPOC獲得（考藤）
MASLDモデルの肝組織ではではクエン酸回路中間体、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸の有意な低下を認めた。DMF類似エステル化化合物、フマル酸ジメチル（DMF）、コハク酸ジメチル(DMS), マレイン酸ジメチル(DMME), マレイン酸ジエチル(DEME), マロン酸ジメチル(DMMO)の５種の介入を今年度検討した。細胞内でコハク酸になるDMS群、コハク酸からフマル酸への代謝酵素阻害作用を持つDMMO群、DMFと同じNrf2活性化作用を持つDEME群、DMFと幾何異性体であるDMME群ではいずれも体重・肝重量増加や肝障害を抑制せず, 病理学的にもMASH様変化を改善しなかった。今回検討したDMF類似化合物や他のクエン酸回路中間体の修飾ではMASH改善効果は判然とせずDMFによるフマル酸を介したMASH改善効果は特異性が高いことが示唆された。
・脂肪毒性回避機構の制御によるMASLD/MASH肝がんの防止（小玉）
脂肪毒性の制御因子ACSL3を同定した。肝細胞特異的ACSL3KOマウスを用いてMASLD/MASHモデル・MASH肝癌モデルにおける肝線維化・肝発がん過程への関与を明らかにする。またMASH肝癌検体を用いて、臨床的意義を検討する。
・血管系再構成iPS肝オルガノイドによる脂肪毒性における1塩基変異を介した憎悪機構の解明（武部）
TM6SF2変異導入株を用いたオルガノイド創出技術を最適化し、それらを正常株と比較することで肝細胞分化誘導が可能であることが示された。さらに、VLDL分泌の評価手法および、それらの分泌促進条件を確立し、脂肪肝評価のための表現型解析系が構築された。
・MASH肝がん特異的腸内細菌の同定とファージ療法の検討（中本）
ノトバイオート技術を用いたヒトフローラ化無菌マウスを用いて、MASH肝がん特異的腸内細菌叢を同定した。MASH-HCC患者由来腸内細菌を無菌マウスに移植し、さらにデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)投与による腸管バリアの破壊により腸管膜リンパ節にバクテリアルトランスロケーションする5菌を同定した。さらに、5菌、および単菌の投与により、肝癌発癌モデルにおいて発癌進展が促進されることを確認し、菌の絞り込みを行った。
・リピドミクス解析基盤の拡充（進藤）
包括的なリン脂質、脂肪酸、エイコサノイド分析技術を確立し研究班内の分析を行う。本年度は小玉グループの分析や金井グループの脂質データ解釈を行った。マウスでは脂質制御餌による肝臓脂質バランス変度を検出した。全14種リン脂質生合成酵素欠損マウスの解析や脂質分析技術向上は引き続き行っている。
・肝発がん過程に関与するKupffer細胞群の同定と制御方法の開発（佐藤）
これまでの解析で、sleeping beauty肝臓がん発症モデル、転移性肝がんモデルの両者でがん抑制の表現型を示した遺伝子欠損（KO）マウスについて、野生型と比較してCD45陽性細胞に占めるクッパー細胞の割合が有意に高くなっており、特にmarker A陽性サブタイプのクッパー細胞が増加していることが分かった。sleeping beauty肝臓がん発症モデルを用いて、担癌状態での野生型、KOマウスそれぞれのDNAマイクロアレイを行い、marker A陰性クッパー細胞はmarker Bの発現によってさらに2つのサブタイプに分かれることを明らかにし、野生型では肝がんの進行とともにmarker B陽性marker A陽性のサブタイプが増加するのに対して、KOマウスでは同サブタイプの増加が見られないことを明らかにした。以上のことから、KOマウスでは加齢や病態形成に伴うmarker A陰性クッパー細胞（特にmarker B陽性）の割合増加が低く制御されており、常にmarker A陽性サブタイプ優位となることで病態形成に対して抑制的な表現型を示すものと考えられた。
marker B陽性marker A陽性のサブタイプのみKOされた骨髄移植キメラマウスでsleeping beauty肝臓がん発症モデルを実施したところ、marker B陽性marker A陽性のサブタイプのKOキメラマウスでがん抑制の表現型が認められた。また、depositされた複数のシングルセルデータの解析を行ったところ、marker B陽性marker A陽性のサブタイプは骨髄由来の単球が肝臓内でクッパー細胞へ分化していく過程において最終分化段階にあることが示唆され、今回着目した遺伝子はその分化過程で経時的に増加していることが明らかになった。
・MASH肝がん微小環境構成細胞（CAF、免疫細胞）制御因子の解明（武冨）
DGKα欠損マウス、DGKζ欠損マウスにMASHモデル作製用飼料を摂取させ、開始6週後および12週後に解析を行った。肝臓組織におけるHE染色像ではDGKα欠損マウスでは他群と比較して脂肪変性の程度が異なる可能性が示唆された。また、肝線維化の評価ではDGKα欠損マウスにおいて線維化がより進行している傾向が認められた。さらに、肝浸潤免疫担当細胞をフローサイトメトリーにて解析したところ、6週時点においてMASH飼料群ではリンパ球浸潤が増加しており、特にDGKα欠損マウスでは他の系統に比べて浸潤T細胞の割合が高いことが明らかとなった。
・MASH肝がんのICI治療抵抗性発現機序（ゲノム、腸内細菌）の解明と制御方法の開発（小玉、中本）
Hep55.1cを用いたマウス肝癌シンジェニックモデルに対して抗PD-L1抗体・抗VEGF抗体治療を行った結果腫瘍の有意な縮小が認められた。同モデルにおいて、NRF2を強制発現させた結果、腫瘍内のリンパ球浸潤が有意に減少し、免疫枯渇型の癌微小環境（TME）が形成され、抗PD-L1抗体・抗VEGF抗体治療に抵抗性を獲得した。同NRF2強制発現モデルにおいて、NRF2阻害剤を投与した結果、抗PD-L1抗体・抗VEGF抗体に対する抵抗性が解除された。以上から、NRF2活性化が免疫枯渇型のTMEを形成しICI治療の抵抗性に関わることが示された（小玉）
進行性肝がんに対するAtezo/Bev治療に対する反応性に関連する腸内細菌を同定した。Atezo/Bev治療に対して有効性を示した患者便をマウスに移植した後肝がん細胞株を肝注し抗PD-1抗体を投与すると、ヒト同様に非投与と比較して癌の進展が有意に抑制されることを確認した（中本）。
・MASH肝がんリスク判別リピドームマーカーの血液検体での測定方法の確立（金井、進藤）
MASLD由来肝発がんリスク予測に有用であることを明らかにした3種のマーカートリグリセリドの血液検体における測定方法を、研究開発分担者進藤らと共同で確立するため、ナショナルセンターバイオバンクネットワークとMTAを締結し検体確保を進めている。
・MASH肝がんエピゲノムマーカーの診断機器の標準化と医療現場への導出（金井）
MASH発がんリスクにかかるDNAメチル化診断に関して、十分な解析精度を有し長期的に安定供給の見込める高速液体クロマトグラフィーカラムを選定し、検体取扱い標準手順書を定めた。実装を担当する衛生検査所 (島津テクノリサーチ)と、受託解析契約書を締結した。
・病理組織検体多層オミックス解析に基づくMASH肝がんの本態解明と発がんリスク診断開発（金井）
未だ肝細胞がんの発生母地となっていないMASLD/MASHを呈する肝組織 (O)と、既に肝細胞がんの発生母地となったMASLD/MASHを呈する肝組織 (W)の間で、エピゲノム・トランスクリプトーム・メタボローム解析結果を比較・統合し、O・W間の代謝プロファイルの相違を創出する可能性のある378遺伝子を同定した。特に、Oに比してのWにおけるDNAメチル化異常が、FAM3B・FAM83F・HSD17B14・PAQR5・SPATA18遺伝子の発現変化をもたらし、脂質代謝異常・ミトコンドリア機能障害・細胞増殖異常を介して発がん促進的に働く可能性がある。