目的とする線維化促進分泌蛋白質の中和抗体を作成するため、KOマウスに対して蛋白質、あるいはplasmid DNAを免疫した。免疫後、経時的に採血して抗体価を測定した。抗体価が十分に上昇したことを確認した後、免疫したKOマウスの脾臓を回収した。その後、常法に従い、数多くのマウスモノクローナル抗体を作成した。その後まずは、フローサイトメーターを用いてこの分泌蛋白質を認識する抗体をスクリーニングした。スクリーニングにより得られた抗体群の中で中和活性のあるものを探索したところ、いくつか弱い中和活性を持つ抗体が取得できたが、十分な活性ではないため、今後、エピトープマッピングを行い、引き続きスクリーニングを行っていく予定である。
一方でその副産物として着目する線維化促進分泌蛋白質をWestern blottingにより認識する抗体、あるいは免疫沈降できる抗体をそれぞれ取得することはできた。我々の本研究の別テーマとしてこの分泌蛋白質が肝線維化のバイオマーカー分子になりうるかの検討がある。得られた免疫沈降可能な抗体を用いて血中の目的蛋白質を免疫沈降して質量分析解析したところ、この分泌蛋白質は肝線維化の進行に伴って血中量が増加することが明らかとなった。
さらにこの分泌蛋白質の線維化促進機構を調べるためにリン酸化プロテオミクスおよびトータルプロテオミクスを行い、ある蛋白質のリン酸化が線維化促進に関与する可能性を見出した。