薬剤耐性菌・薬剤耐性遺伝子を対象とした下水サーベイランスの手法を確立するために、日本の複数の都市から下水を採水した。また、海外からの観光客等によって国内に持ち込まれる薬剤耐性菌・薬剤耐性遺伝子を評価するために、国際空港における飛行機汚水や外国人観光客が多く訪問するインバウンド観光施設の下水も採水し、一般の都市下水との比較も行った。都市下水中の薬剤耐性マーカーとしては、セフォタキシム耐性大腸菌を培養法で計数すると共に、クラス１インテグロンインテグラーゼ遺伝子を定量PCRで測定し、国内の都市下水のベースラインを評価した。また、薬剤耐性遺伝子の包括的な監視のために、ハイスループット定量PCRとハイブリッドキャプチャー濃縮を組み合わせたターゲットシーケンシングの手法を検討した。
　下水中の薬剤耐性遺伝子は、細胞内だけではなく、細胞外にも溶存態DNAとして存在している。こうした細胞外画分の薬剤耐性遺伝子は形質変換による水平伝播に寄与する可能性が指摘されているが、その実態については十分に明らかになっていない。今年度は、細胞外DNAの回収方法として、UF膜による回収方法とイソプロパノール沈澱による回収方法の2種類を検討した。検討の結果、UF膜による回収方法の方が、低濃度試料の細胞外DNAを効率的に回収できる傾向が確認された。また、定量PCRの結果、sul1, ermB, aadAなどの薬剤耐性遺伝子が細胞外DNA画分に含まれていることが明らかになった。
　下水サーベイランスを薬剤耐性菌・薬剤耐性遺伝子に拡張する上で、先行して社会実装されているウイルスサーベイランスと協調した手法が有用である。そこで、ウイルス画分の回収について実績のある磁気ビーズを用いた下水中の細菌画分・ウイルス画分の同時濃縮を検討した。フィルターで細菌画分を回収する通常の手法と比較すると、磁気ビーズによる細菌画分の回収率は約1/3と低いものの、16S rRNA遺伝子により対象遺伝子を標準化すれば、フィルターによる回収と磁気ビーズによる回収は同程度の結果を示すことが確認された。