ノックダウンカセットによるT細胞の遺伝子改変
単鎖化抗ヒトCD28抗体配列にKDEL配列を結合した遺伝子を活性化T細胞に遺伝子導入したところ、T細胞上のCD28発現は2日目で1/5以下に減少、5日目には消失した。次いでCD28分子の膜貫通領域以下を免疫チェックポイント分子で置換したキメラ分子をT細胞に導入、CD3/CD28抗体で刺激しT細胞の増殖を観察したところCD28キメラ分子を導入したT細胞ではほぼ増殖を認めなかった。KDEL法に比較しCD28キメラ分子は1－2日以内に発現するため、移植後のT細胞活性化の時期を考えるとCD28キメラ分子による機能的ノックダウンがより臨床応用性がある。移植する全T細胞に本キメラ分子を発現するにはmRNA導入による一過性発現が安全と考え、遺伝子導入方法の適正化を進めている。なおMHC半合致マウス移植にPTCyを用いた移植モデルにおいてアバタセプトを投与した場合には予後・GVHDが改善することが確認出来ており、開発中のCD28経路阻害がこれを上回るかを次年度検討する。
二重特異性抗体作成と機能検証
昨年サイトカインX（CX）-単鎖CD28抗体のキメラ分子がCX受容体を介して細胞内に取り込まれることを確認した。mCherryを結合したCD28分子をT細胞株に導入しCX-単鎖CD28抗体を添加したところ、1時間後には大部分のmCherryが細胞質内に移動した。しかしmCherryの安定性が高くCD28とともに分解された証明が十分得られなかった。また添加するCX-単鎖CD28抗体の培養液内での安定性が短いためEpi293細胞を用いた生産を行い、大量の精製蛋白を得る方法を確立した。またCX受容体の発現量がCD28に比し低いため、これに代わるT細胞上の標的分子を検索し候補CDyy分子について検討を進めている。
HLA抗原特異的TCR-T細胞の養子免疫療法の確立
白血病細胞が持つHLA-DPに特異的なTCR遺伝子導入T細胞は、CD19-CAR-T細胞のように全てのB細胞腫瘍に応用できる汎用性はなく、各HLA-DP型に対応する多数のTCRが必要となり、ウイルスベクターで作成するのは現実的ではない。このためTCRをコードするmRNAを導入したLNPを作成し、これを効率良く導入するためにLNPとT細胞を積極的に結合させるリンカーを開発した（出願準備中）。