GJB2遺伝子の突然変異を原因とする難聴（GJB2変異型難聴）は遺伝性難聴の約半分を占めており、国内の患者数は約３万人とされる。その多くは高度から重度の先天性難聴となる重篤な疾患であるが、現時点で根本的な治療法は存在しない。我々はGJB2変異型難聴の遺伝子治療のため新規のカプシド改変型AAVベクターを開発し、GJB2遺伝子の補充により難聴モデルマウスの聴力を回復させることに成功した。これはヒトに適用しうる手法として世界初のPoCである。本研究課題では本治療法の治験に向けた準備として非臨床安全性試験やAAVベクター製造のプロセス開発を実施する。以下、本年度の成果を項目別に示す。項目（１）「被験物質の薬効試験」については、難聴モデルマウスでの聴力回復試験結果に基づき、非臨床試験に供するカプシドとプロモーターを最終決定した。AAVベクターの作用機序およびヒトへの外挿性を確認するため、GJB2変異による重度難聴患者のiPS細胞から疾患モデル細胞を製造し、AAVベクターを感染させることで、目的タンパク質の量および構造の回復を認めた。またddPCR法によるAAVベクターの検出法を確立した。項目（２）「被験物質の製造・品質評価」については、まず安全性と発現効率の向上のためにGJB2遺伝子の塩基配列を最適化した。最適化GJB2と上述のカプシド、プロモーターを持つAAVベクターの製造プロセスについて、産生から精製までの条件を最適化し、5リットルスケールまでの検討を完了した。項目（４）「内耳投与手術法の検討」については、ウイルスベクターの内耳投与手術のためにカスタマイズした針を試作し、また生体サルを対象に術式の検討を重ね、人工内耳手術と同様の後鼓室開放による投与法を確立した。項目（６）「治験準備」については、プロトコルの検討の一環としてGJB2遺伝子による難聴患者384名を対象に難聴の重症度に影響を及ぼす他の遺伝的因子に関して検討をおこなった。また、今までの遺伝子解析研究でGJB2遺伝子による難聴と診断された1000例を対象に臨床的特徴を取りまとめ治験対象患者の適応範囲の選定をおこなった。