【課題全体としての研究成果】
本研究課題では,申請代表者である東京大学・吉本らの研究グループが独自に開発したDNAアプタマー史上最高の抗凝固活性をもつ二重特異性 DNA アプタマーを,血栓症リスクが極めて高い遺伝性素因であるアンチトロンビン欠乏症（指定難病・327）が引き起こす血栓性疾患に対する治療薬として新薬臨床試験開始（IND）申請することを目標とする. 本年度は,二重特異性 DNA アプタマーの候補分子の中から非臨床試験ステージに進む候補を絞り込むとともに,動物投与実験の結果を基に,動物を用いる血中動態実験・一般毒性試験での基準となる投与量と投与経路を決定した. また,次年度以降に予定している各種毒性試験で使用するDNA の大量合成を依頼するCDMO を選定し,大量合成に関する「製造プロセス・初期検討」を実施した. 本研究課題において開発した二価アプタマー (64塩基長)の vivo における抗凝固活性は, 2倍量以上の単量体アプタマー (36塩基長)よりも高く, 多価化により本アプタマーの薬理活性が大幅に向上したことが示された. また, 50倍の大量投与実験においても,異常行動をきたす個体や観察時間終了後の剖検において出血を呈している個体は無く, 本薬剤候補化合物の安全性が示された.
【分担研究開発課題としての研究成果】
・東京大学
研究開発項目(1) 二重特異性アプタマー候補の決定
二重特異性アプタマーの短鎖化およびスケールアップ合成による抗凝固活性への影響評価を行い,抗凝固薬として動物実験に適した二重特異性 DNA アプタマーを選定した. 具体的には,アプタマーの結晶構造解析結果を基に, 6種類の二重特異性短鎖化アプタマーを設計・作製し, 鎖長の最適化を実施した. 鎖長の短鎖化はアプタマー合成において収率の向上やコスト削減を実現するための有力なアプローチである. 実験の結果, 機能を保持したまま40 塩基長以上の短鎖化に成功した.絞り込んだ2種類の短鎖化アプタマー候補配列 (64塩基長および 60塩基長)について,スケールアップ合成(100 mg)を行い, 抗凝固活性の評価を行った. ヒト血漿とマウス血漿中の抗凝固活性を測定した結果,少量合成アプタマーと同等以上の抗凝固活性を示すことを確認した. さらに,奈良県立医科大学と外注委託機関による動物投与実験の結果,64塩基長アプタマーは60塩基長アプタマーよりも強い活性と長い半減期を有していることが確認された. 本アプタマー群は安全に使用が可能な中和剤を有する薬剤としての開発を目指しており,半減期が長いことはリスクを増大させることなく,患者負担の軽減,投与総量減量につながると考えられる. 従って,非臨床試験用のアプタマーとして64塩基長アプタマーを選定した.
研究開発項目(5) 二重特異性アプタマーの血中動態の確認
二重特異性アプタマーの体内動態（血中半減期・臓器集積性）をGLP レベルで評価するため,血漿中における核酸濃度のin vitro測定法の検討を行った. 外注委託機関と連携し,まずハイブリダイゼーション法の可能性を検討したが,同一配列が連続する二価アプタマーを定量的に検出できるプローブの設計は困難を極めた. そこで,次に,質量分析計（MS）を利用する検出・定量法を試みた. 検出に適した前処理方法等について検討を行った結果,血漿中において核酸の測定が可能であることを確認した. 今後は,本手法を用いて実際にex vivoで採血した血漿中のアプタマーの直接定量を行う予定である.
・奈良県立医科大学
研究開発項目(3) 正常動物におけるアプタマーの投与経路・投与量の決定
研究開発項目(1) で選定された二重特異性アプタマーの投与経路と投与量を決定した.予備検討として少数の野生型マウスにアプタマーを投与し,外注委託でマウスに投与するアプタマー用量（低用量0.03μmol/kg,中用量0.05μmol/kg,高用量0.07μmol/kg）と採血タイムポイント（投与5 分後,10 分後,15 分後,30 分後,60 分後）を設定した. 投与経路の決定に際しては,頸静脈投与と外注委託機関において一般的な尾静脈からの投与後の結果の比較を行い, 両者で遜色のない結果が得られたため,投与経路を尾静脈に決定した.外注委託機関での結果をもとに治療効果を発揮する想定濃度は（0.02μmol/kg/匹）とした。本検討で採取した血漿は今後アプタマー直接定量に用いる予定である.
研究開発項目(4) DIC モデルマウスを用いる効果検証
LPS を用いたDIC モデル構築とトロンビンを用いたDIC モデル構築を試みた. LPS モデルでは動物倫理に抵触しない実験を実現した一方で,LPS 高用量投与マウスであっても病態が極軽度であり,今後アプタマーの効果を検証のためには,最適化が必要と考えられた.トロンビンを用いたDIC モデルは従来手法は肺血栓塞栓による死亡を誘発するモデルであり,動物倫理上問題であるため,極少量のトロンビンを投与する予備検討を行った. 結果,少量のトロンビンであれば死亡を回避しつつ血栓誘発が可能であることが確認できた.
さらにDICモデルに変わる評価法としてPIT 法を検討した,外注委託業者と連携し, PIT法で既存の抗凝固薬であるアルガトロバンの薬効が確認できるかを検証した. アルガトロバン投与量は,既存の報告を基に投与したが,APTT 法で十分な変化を確認できなかった. 一方,閉塞時間評価ではアルガトロバン投与群で薬効を認めた.
研究開発項目(9) その他の研究項目
薬剤副作用の確認手法の確立および中和剤の薬効確認手法を確立する目的で尾出血量定量法を検討し, 外注委託業者において, 出血量が少ない薬剤非投与のマウスであってもヘモグロビンをベースとした正確な出血量定量が可能であることがわかった.
半減期延長を目指したアルブミン結合性アプタマーの検討では十分な効果を確認することができなかった.
・株式会社リンクバイオ
研究開発項目(2) アプタマー製造法
原薬の大量製造に向けて,DNA合成に関する評価（コスト,純度,納期）を複数の外注先に対して行った. また,納品されたDNA の品質をリンクバイオ社内で評価する手法（CE(キャピラリー電気泳動法）を確立し,品質確認を行った. これらの結果を基に,次年度以降に予定している各種毒性試験で使用するDNAの大量合成を依頼するCDMOを選定した. 選定根拠は,(1)合成DNA100 mg 製造品についてキャピラリー電気泳動法を用いて評価した結果,(2)「短期間における大量合成設備を保有している」等の企業が保有する設備条件,(3)vivoにおける高い薬効（投与量・製造量の低下に繋がる）である. さらに,選定したCDMOにおいて「製造プロセス・初期検討」を実施した.並列して,DNAの大量合成発注に対する価格と納期について交渉を進めている.また,臨床試験用DNAの確保にむけて,リンクバイオ社が中心となり複数の独立系ベンチャーキャピタルと面談・交渉を行った. 今後は,独立系VC だけでなく,非独立系VC,CVC,エンジェル投資家などにも対象を広げる予定である.