先天性大脳白質形成不全症の代表的疾患Pelizaeus-Merzbacher病（PMD）は、乳児期より生涯に渡って重篤な障害を呈する小児の難治性遺伝性疾患で、中枢神経系（CNS）の髄鞘形成不全と乳児期発症の重度運動発達障害を呈する。治療法はない。PLP1遺伝子の変異が原因で、アミノ酸置換変異やゲノム重複は機能獲得変異として重症となるが、欠失などの機能喪失は極めて軽症であることから、PMDの分子治療としてPLP1遺伝子発現の抑制的制御により、この疾患を治療できると考えられる。この仮説に基づき、最近アンチセンスオリゴ（ASO）やAAVに搭載した人工miRNAによるPLP1抑制治療がそれぞれアミノ酸置換変異とゲノム重複によるPMDモデル動物に対して有効であることが示されている。ASOは臨床応用に最も近いモダリティであるが、髄注からの繰り返し投与が必要であるため患者負担が大きい。研究代表者らはこれまで単回投与で治療が完結する人工miRNAを搭載したAAVの開発を進めてきた。しかしその有効性の一方で、治療効果が不十分など限界もあることを認識した（未発表データ）。そこでこれらの課題を克服できる第３のモダリティとして、我々はゲノム編集AAVベクターを用いたPLP1遺伝子発現抑制治療法の開発を開始した。本研究では、新たなプラットフォームとしてAAVに搭載可能な小分子cjCas9を用いたゲノム編集によりエンハンサーを標的としたPLP1遺伝子発現抑制治療によるPMDに対する根治療法を開発し、研究代表者が確立している疾患マウスモデルおよび患者由来iPS細胞を用いて、その治療効果に関するPOCを得ることを目的とする。
令和６年度は下記の課題に取り組み、以下の成果をあげた。
(1) 標的エンハンサー配列の探索とゲノム編集モジュールの設計と最適化
ヒトPLP1プロモーターをルシフェラーゼの上流に配置したレポーターアッセイを用いて、その上流に各遠位エンハンサーを挿入し、転写活性に与える増幅効果を定量的に測定し、より効果量が大きいエンハンサーを同定した。
(2) cjCas9モジュールを用いたシングルAAVベクターの作成と最適化
現在、主に用いているイントロン１内のエンハンサーを標的としたゲノム編集治療用AAVベクターの最適化を行った。プロモーターおよび血清型の組み合わせを確定し、これを用いた野生型マウスおよび疾患モデルマウスでの治療効果の検証を行った。