令和6年度は、福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）における深部イントロン変異（DIV）に対する新規エクソン・スキップ療法の開発を目的として、人工キメラRNA分子の設計および効果検証を中心に研究を推進した。ヒト型イントロンを組み込んだFktn deep intronの疾患モデルマウスの作製を試みたが、イントロンの部分配列のみノックインされたマウスしか得らなかったため、新たにイントロンを短くしたレポーターミニ遺伝子を作製した。その結果、長さを約半分にまで短くしたレポーターでも点変異特異的にスプライシング異常が誘導され、さらに4.5SHキメラ分子で効率の良いスキッピングを誘導できることがわかった。現在最終的な配列を合成中であり、合成後すみやかにiGONAD法やノックイン法を検討しDIVノックインマウスを作製し、モデル動物での表現型、遺伝子型を検討したのち治療効果判定を行う予定である。
並行して、分担研究者らの開発による4.5SH RNA由来の人工キメラRNA分子を設計し、FKTNの異常スプライシング部位に対して高効率かつ高特異性のスキップ活性を有する候補分子を作成した。これらの分子は、90%以上のスキップ効率を持ち、従来のアンチセンス核酸治療を上回る可能性を示した。さらに、選定された分子をAAVベクターやレンチウイルスベクターに搭載し、細胞投与による発現持続性やスキップ効果の初期評価を開始した。結果として期待されるスキッピング効率が得られず、原因としてiPS細胞でのサイレンシングや、キメラRNAの分解などほかの原因が示唆され、現在その原因を解明するためにRNAseqやノザンハイブリダイゼーションなどを検討している。iPS細胞を用いた治療評価においては、骨格筋や神経組織への分化誘導後、ウエスタンブロットや免疫染色によりフクチンおよびαジストログリカンの糖鎖修飾回復を確認したが劇的な改善が現時点ではみられていない。従来、FKTNのDIVに対して設計された人工キメラRNAは、pol III依存的な転写を必要とすることから、利用可能な遺伝子治療用ベクターが限られていた。本研究では、配列Xの導入によりこの制約を克服し、より多様なベクターへの搭載が可能となる設計を実現することで、応用面での汎用性の向上が期待される。
以上により、令和6年度は治療戦略における分子設計、評価系構築、モデル確立にむけ検討を重ねた。引き続き次年度以降はin vivo機能評価および薬効・薬理バイオマーカー解析への基盤を築く。