本研究では、ヒトiPS細胞からの永久軟骨様組織の誘導技術を開発することを目的とし、GDF5系譜誘導因子候補であるMEK阻害剤を用いた分化誘導法の最適化と、その分子特性の解析を行った。まず、永久軟骨と成長板軟骨の誘導を区別するため、GDF5およびSP7をそれぞれレポーターとしたiPS細胞株を樹立し、各条件での誘導効率を評価した。
MEK阻害剤添加群では関節軟骨マーカーが、BMP/TGFβ高濃度群では成長板軟骨マーカーがそれぞれ優位に発現し、RNA-seqにより両群の明確なトランスクリプトーム上の分化差が確認された。さらに、ATAC-seq解析では、MEK阻害剤によりGDF5プロモーター領域がオープン化され、ヒストンアセチル化が確認された一方、SP7ではすべての群でオープン状態であったが、骨化しない群ではプロモーター領域にメチル化による抑制が認められた。
加えて、シングルセルRNA-seq解析を通じて、得られた細胞がヒト胎児四肢由来軟骨細胞と高い類似性を示すことを確認した。作製した軟骨組織体を免疫不全マウス皮下に移植し、3ヵ月後に回収した組織をμCT、電子顕微鏡、免疫染色で解析した結果、MEK阻害剤群では骨化が抑制され、ACANやCOL2の持続的発現が確認され、安定した永久軟骨様フェノタイプの維持が示された。
さらに、Bulk RNA-seqより永久軟骨誘導に関与する可能性のある転写因子51個を抽出し、機能解析を進めている。予備研究としては、CATポリマーを用いた三次元培養系により、細胞播種密度の最適化を通じて均質なリング状軟骨組織体の作製に成功し、皮下移植により強度の向上も確認された。最終的に、免疫不全ラットの気管に板状軟骨組織体を直接移植した結果、1ヵ月後には組織の生着と気道粘膜上皮による被覆が確認され、本技術の再生医療への応用可能性が示された。