研究代表者がこれまでに見出した、遺伝子改変により誘導される特徴的なNK細胞集団について、分子プロファイル解析と分化経路の解明を進めた。遺伝子Aを修飾したNK細胞をin vitroで抗原刺激を加えながら培養増殖させると、コントロールNK細胞が2週間程度で増殖能を失うのに対して、6週間以上に渡って増殖が維持された。未分化性を特徴付けるマーカー候補として同定している分子Xの発現を追跡すると、遺伝子Aの修飾を行うことで、非修飾NK細胞では早期に失われるのに対して、培養5週間時点でも高度に維持されており、自己複製能の向上が示唆された。そこで遺伝子修飾KOあり、なしのNK細胞について単一細胞RNAシークエンスを行い、遺伝子修飾により維持される細胞集団の特徴を解析した。また、PRDM1修飾と並んでサイトカインシグナルの重要性が抗腫瘍効果の増強に寄与することを同定していることから、本研究で開発する最終的な改変CAR-NK細胞にはサイトカインシグナルも組み込む計画としている。そこで、遺伝子Aの改変と共役してNK細胞機能を高めることに寄与するサイトカイン分子を探索し、サイトカインBのシグナルを組込むことでin vivoにおける長期生存能、及び抗腫瘍効果が顕著に高まることを確認した。実用化に向けては、CAR-NK細胞培養プロトコールの検討を進めた。これまでにK562細胞に膜型IL-21及び4-1BBLを発現させて共培養を行うことで十分な増殖が得られていたが、フィーダーフリーの培養方法について検討を行い、複数のサイトカイン投与を組み合わせることでNK細胞が増殖し、レンチウイルスによる遺伝子導入が可能であることを確認した。