研究開発代表者らは、大腸がんを自然発症して肝転移に至るマウスモデル（CKPSマウス）を作出し、同マウス由来の大腸がん細胞株（CKPS細胞）を用いた解析により、CKPS細胞のスフェロイド培養移行時に同じシグナル経路に属するプロテインキナーゼXとYの活性が上昇すること、Xのノックアウト（KO）によりCKPS細胞の転移形成能が顕著に低下し、YのKOでも有意に低下することを見出した。さらに、X-KO CKPS細胞から生じる肝転移巣は分化傾向を示し、化学療法薬に対する感受性が高いことも分かっていた。本研究開発では、大腸がん幹細胞を標的とした新しい治療法の開発につなげることを目的として、Xのキナーゼ活性阻害による大腸がん幹細胞分化誘導戦略の構築、ならびにX下流分子の大腸がん幹細胞性における役割の解明と治療標的資質の検証を行っている。本年度は、誘導性XノックダウンCKPS細胞の皮下移植モデルを確立し、腫瘍生着後のXノックダウンによる腫瘍抑制効果の検討を開始した。また、XをKOしたヒト大腸がん細胞株HT29、DLD-1による移植腫瘍はAlcian blue染色陽性の粘液分泌細胞への分化傾向を示したが、XをKOしたSW480やHCT116による移植腫瘍は分化傾向を示さなかった。さらに複数の大腸がん患者由来オルガノイドでXをKOしたところ移植腫瘍の分化傾向は多様で、XのKOによる大腸がん細胞の表現型変化は不均一であることが示された。これらの成果に基づき、X阻害に対する感受性の規定因子およびX経路活性化状態を示すバイオマーカーの探索を開始した。また、前年度に検討したX阻害化合物候補の類縁体の１つが、in vitroおよびin vivoでX経路を抑制する可能性を見出した。Xの下流分子に関しては、上市薬・臨床試験化合物から選択されたY阻害化合物候補の１つがin vitroでYを阻害することを確認した。一方、前年度に関与が示唆されたXの下流分子Bについて、２つのアイソフォーム(B1, B2)を共にKOしたCKPS細胞は親株と比較して転移能が低下していた。さらに別の下流因子Cについて、３つのアイソフォーム（C1, C2, C3）を全てKOしたCKPS細胞による転移巣が粘液分泌細胞への分化傾向を示し、Xの下流で未分化性維持に関与する可能性が示唆された。