研究開発項目（1）GREB1 ASOと細胞膜透過ペプチド（CPP）およびエンドソーム脱出促進剤（CAD）との併用による薬効増強効果の検討
肝がん細胞を用いた検討により、細胞内へのASO取り込みを促進する3種のCPPを同定し、特にC末端に正電荷ペプチドを有する構造が有効であることが示唆された。また、ASOの効果を増強する3種のCADを見出し、化合物Xにより細胞毒性を抑えつつ標的遺伝子を効果的に抑制するFADE法（Free-uptake Antisense oligonucleotide Delivery with Endosomal escape）を確立し、困難であった神経芽腫細胞へのASO導入に成功した。
研究開発項目（2）GREB1 ASOを基盤としたヘテロ二本鎖核酸（HDO）の設計と薬効評価の実施
4種類のASO配列に対して相補的RNA鎖を導入したGREB1 HDOはいずれもASO単独より高い発現抑制効果を示し、あるHDOは低濃度条件で約95%の発現抑制効果を示した。さらに、肝がん細胞皮下腫瘍モデルでのHDO静脈内投与により40%程度のGREB1発現抑制を確認した。
研究開発項目（3）GREB1の発現制御に関与するNatural antisense transcript（NAT）の全長解析と機能解析
GREB1遺伝子のコード領域に見出したNATは、従来全長が不明であったが、新たなロングリードRNA-seq技術を用いてその全長を同定した。siRNAおよびASOを用いたNATのノックダウン実験により、GREB1の発現が顕著に低下し、NATがGREB1の発現制御に重要であることが示された。
研究開発項目（4）GREB1を介した抗腫瘍免疫制御の分子機構の解析
HTVi法により正常免疫マウス肝臓にGREB1高発現肝がんモデルを作製し、同モデルより樹立したオルガノイドおよび細胞株の同所移植モデルを構築した。また、BMyc-GREB1 KOマウスモデルを作製し、GREB1によるがん免疫微小環境制御機構を解析した。
研究開発項目（5）FADE法の応用可能性と妥当性の検証
神経芽腫細胞においてリポフェクション法とFADE法では細胞毒性について明らかな差は認められず、RNAシーケンスでの比較解析の結果、後者ではGREB1に対する高いノックダウン効果を示し、GREB1欠失による表現型をより強く示すことが判明した。また、肝がん細胞皮下腫瘍サンプルについて空間的遺伝子発現解析を行ったところ、GREB1の発現が低い領域は免疫細胞の浸潤が強い領域に近接しており、腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイルが周囲と異なっていた。