本研究は、がん抗原特異的環状一本鎖抗体（環状scFv）とT細胞特異的環状scFvをリンカー分子で結合させた二重特異性T細胞誘導抗体（BiTE抗体）の開発と評価を目的とする。令和６年度は下記の成果が得られた。
（１）令和５年度に特許出願した手法に従い、anti-HER2環状scFvとanti-mCD3環状scFvをPEGリンカーで連結したBiTE抗体（anti-HER2/mCD3_PEG型BiTE抗体）の生産量を向上するため、構成ユニットである各環状scFvについて高品質化を行い、最終的にBiTE抗体の生産量を大腸菌発現系で３倍程度増大させた。また、高品質化を施したanti-HER2環状scFvについて、CHO培養細胞系で調製したところ、その生産量を10倍程度向上増大させた。しかしながら糖鎖修飾が観察されたので、その検討を進めている。
（２）自己集合型ペプチドリンカー（アンチパラレル型）を用いてBiTE抗体（anti-CD19/CD3_ペプチド型BiTE抗体）を調製した。DSF測定による熱安定性解析、ならびに、表面プラズモン共鳴法およびPull-down assayによる抗原結合活性の解析を行い、BiTE抗体のタンパク質物性を評価した。さらに、T細胞依存性細胞障害活性評価を行い、自己集合型ペプチドリンカー型BiTE抗体が新規フォーマットとして応用可能であることを示した。
（３）B16F10マウスメラノーマ細胞にHER2抗原を発現させた腫瘍細胞株を皮下移植したC57BL/6担がんマウスにBiTE抗体（anti-HER2/mCD3_PEG型BiTE抗体）を腹腔内投与し、抗腫瘍活性を評価した。その結果、BiTE抗体が腫瘍の成長を顕著に抑制させることを確認した。さらに、HER2陽性B16F10細胞をアルビノC57BL/6マウスに尾静脈投与した肺転移マウスモデルに対して、BiTE抗体を腹腔内投与し、解剖後に腫瘍の状態を観察した結果、BiTE抗体の投与により肺における腫瘍数が有意に大きく減少していることが確認できた。加えて、肺以外の臓器への腫瘍転移もBiTE抗体投与により抑制されていることが明らかとなった。すなわち、anti-HER2/mCD3_PEG型BiTE抗体がHER2陽性担がんマウスおよび肺転移がんモデルで抗腫瘍活性を示すことを明らかすることができた。
（４）HER2陽性B16F10細胞を皮下移植したC57BL/6担がんマウスに、放射性同位元素I-131で標識したanti-HER2/mCD3_PEG型BiTE抗体を腹腔内投与して4時間後に、組織集積性、臓器分布をガンマーカウンターで解析したところ、BiTE抗体の腫瘍組織移行性を確認することができた。
（５）アンチパラレル型BiTE抗体の形成のためのE3およびK4ペプチドを化学合成し、（２）にて記載した新規BiTE抗体フォーマットの調製に用いた。また、ヘテロ六量体型自己集合型ペプチドリンカーによる多価化BiTE抗体の作製に用いるHIV外膜タンパク質gp41のNHR由来36残基のペプチド (N36) とCHR由来35残基のペプチド (SC35EK) の分子設計ならびに合成を行った。本ペプチドは、熊本大学にて多価型BiTE抗体の調製法の検討に用いる。