本研究は、がんを標的とした核酸医薬の実用化を目指し、細胞指向性を高めるリガンド、革新的なドラッグデリバリーシステム（DDS）、および複数の遺伝子を同時に抑制するマルチターゲット型siRNA（mt-siRNA）の開発を行うものである。R6年度には、既知の細胞指向性リガンドであるcyclic RGDペプチド（cRGD）および葉酸（Folate）をsiRNAの3'末端に導入し、これをY字型ブロック共重合体（YBC）と複合化してunit poly-ion complex（uPIC）を構築した。これらのリガンド化siRNA/uPICについて、がん細胞への取り込み効率、血中滞留性、および腫瘍集積性を評価した。in vitroでの細胞取り込み試験では、インテグリンおよび葉酸受容体（FR）が高発現している卵巣がん細胞株を用いた。蛍光標識を施したcRGD-siRNAまたはFolate-siRNAを、核酸とYBCの比率を最適化して混合し、一定時間後にフローサイトメトリー（FACS）解析を実施した。その結果、いずれのリガンドsiRNAも細胞内への有意な取り込みが確認され、リガンド修飾の有効性が示唆された。in vivoでの体内動態評価には、生体内共焦点レーザー顕微鏡（IVRTCLSM）を用いた。マウスに対して蛍光標識siRNA/YBC複合体を静脈投与し、耳介部の蛍光シグナルを経時的に観察することで、血中滞留性を定量的に評価した。さらに、腫瘍集積性の評価にはDorsal Skinfold Chamber（DSFC）法を採用し、腫瘍血管および腫瘍への実時間での集積を可視化した。実験の最後には、IVISイメージングシステムによる全身蛍光画像の取得と、解剖後の腫瘍および主要臓器での蛍光シグナル解析を行い、リガンド-siRNAの腫瘍指向性を明確に確認した。加えて、新規のターゲティング分子として、サメ由来シングルドメイン抗体であるVariable New Antigen Receptor（VNAR）に着目し、その中でも上皮成長因子受容体（EGFR）に対する高親和性を有するVNARの可変領域に基づいて、より小型化された「ミニチュアVNAR（mVNAR）」の開発およびsiRNAとのコンジュゲーション手法の確立を計画している。R6年度には、EGFRの発現を指標に対象がん腫の絞り込みを行い、頭頚部がん細胞株において、すべての検討株でEGFRが高発現していることを確認した。現在、抗EGFR VNARに基づいたmVNARの設計と最小構造化を進めており、in silicoモデリングによる改変も並行して実施している。これにより、R7年度にはmVNARとsiRNAのコンジュゲート形成へと移行する準備が整いつつある。さらに、頭頚部扁平上皮癌における治療効果を最大化することを目的に、複数の遺伝子を同時に標的とするマルチターゲットsiRNA（mt-siRNA）の設計を進め、R6年度内に設計を完了した。R7年度には、このmt-siRNAを用いたin vitroでの薬効評価を行い、最も抗腫瘍効果の高い配列を選定するとともに、DDS担体であるYBCとの複合化を想定した化学修飾を導入し、修飾による遺伝子抑制活性への影響の有無を確認する予定である。これら一連の成果は、本プロジェクトが目指す「頭頚部がんに対する核酸医薬の実用化」に向けた重要な技術的基盤を形成するものであり、特に抗EGFR mVNAR抗体の開発は、今後の頭頚部がん治療における新たな選択肢を提供する可能性を有している。