孤発性ALS患者メタボローム・エクソソームmiRNA・蛋白質メチル化を起点とする双方向TRは以下のように進捗している。
研究開発項目１では、孤発性ALS患者由来iPS細胞から分化した運動ニューロンを用いた、薬効のアッセイ系を樹立し、それを用いてPF-04457845がモデル細胞、動物と同様に、ヒト病態においても運動ニューロン保護作用を持つことを見出した。また、S-アリルシステイン代謝の解析については、モデルマウスへのS-アリルシステイン投与実験を行い、脊髄のメタボローム解析から、S-アリルシステインがnicotinamide代謝の活性化をもたらすことを見出し、ミトコンドリア代謝の活性化を介した運動ニューロン保護効果を持つことが示唆された。またPF-04457845と同様に孤発性ALS患者由来iPS運動ニューロンのアッセイ系で有効な薬効が示され、双方の薬剤で臨床応用への有用性が期待される進捗である。
研究開発項目２では研究開発項目４で見出したALS患者で減少するmiRNA の標的遺伝子の解析を目標にした。前述のように孤発性ALS患者iPSC運動ニューロンによるアッセイ系を樹立しており、レンチウイルスを用いたmiRNAの導入により、細胞保護効果を確認した。
研究開発項目３は、今年度、免疫沈降をマグネットビーズに抗体を張り付けてから行う直接法ではなく、まず抗体とサンプルを反応させてから行う間接法に変更し、収量を増加させ、ヒト脳由来のIgGをIgGカラムで除去したところメチル化蛋白質の同定が可能となり、脳特異的なhnRNPがALSでメチル化が亢進していることなどが同定された。
また患者の脳サンプルで認められたメチルFUSと思われる100kDa付近の高分子について、メチルFUSがALS特異的なFUS変化を示している可能性を考えて、その性質、構造の同定を行った。100kDaFUSはメチルFUS抗体では免疫沈降で捉えられなかったため、限外濾過-HPLCの組み合わせで精製し、質量分析を行った結果、FUSであることを確認し、DTT処理で50ｋDa分子に解離することがわかり、この高分子メチル化FUSは50kDaの断片化FUSのダイマーであることが示唆された。
開発項目４では東レ製miRNAマイクロアレイを用いてエクソソーム由来のmiRNAプロファイル測定したデータの前処理パイプラインを2023年度に開発しその論文が2024年度にBMC Bioinformaticsへ受理された。このパイプラインを用いてALS患者と健常者で差のあるmiRNAを同定した。さらに細胞実験細胞 (SH-SY5YへのTDP-43変異導入株)に同定したmiRNAを導入した株と未導入株を用意し、RNA-seqを実施し、当該miRNAによるパスウェイの違いを評価した。その結果、miRNA導入株でp53パスウェイの活性低下、アポトーシスの活性低下が起きていることが確認された。血中のエクソソーム解析で当該miRNAがALS患者で低濃度であったという結果を踏まえると、本結果はALSでは当該miRNAが低下し、p53パスウェイが活性化し、その結果アポトーシスが引き起こされ運動ニューロンの死が加速する可能性を示している。