PTEN遺伝子多型の機能的アノテーションを行う目的で、当初mTOR経路活性化マウス乳腺正常オルガノイド（Pik3ca^H1074R+Ptenノックダウン）を用いてmTOR阻害剤に対する感受性変化を指標にアッセイ系の構築を試みた。しかし、同細胞は(1) mTOR経路への依存が強いため野生型PTENが低レベルの発現しか達成できず陽性コントロールとして不適、(2)VUS導入により誘導される薬剤感受性の変化はアッセイ系としてのダイナミックレンジが小さい、などの問題があることが判明した。一方、並行して進めていた患者由来オルガノイドを用いた検討でもPTEN変異子宮体がんではmTOR経路への依存が強く野生型PTENが全く導入不可能だった。ただし、p53欠損でPTEN野生型のためmTOR経路への依存性がない子宮体がんでは問題なく導入可能で高レベルの発現が可能であることを前年度までに確認していたため、本年度はPTEN欠損にも関わらずmTOR経路へ依存性がない子宮体がんを試したところ、PTEN野生型が導入可能で高レベルの発現が可能であり、pAKTが顕著に抑制されることを確認した。機能既知の8変異を用いた検討では全て同程度のPTEN発現量でありながら、mTOR経路を活性化するlipid phosphatase失活変異のみがpAKTに変化がなく、その他ではPTEN野生型と同程度にpAKTを抑制することを確認した。そこで、ClinVar（疾患関連変異）、ToMMo（日本人集団頻度）、gnomAD（多様な集団における頻度）、COSMIC（がん変異）、PROSITE（機能ドメイン）などのデータベースとAI予測を統合することで選抜した多型を順次合成して導入を行った。本年度は80多型の評価が終了しており、pAKTの抑制率をPTEN発現量で補正する指標を用いることでダイナミックレンジの十分に大きい評価が可能であることを確認した。興味深いことに、従来PTEN発現が低下する多型は病的と予測されていたが、野生型と同様にpAKTを抑制するものも複数存在することや、配列からは良性と予測されるが実際には病的のものも同定された。これらの結果はin silicoでの配列に基づく病原性予測の限界とin vitroでの検証の重要性を強く示唆した。順次評価を継続しており遺伝子合成が完了している200多型まで評価予定である。