まず、我々は2つの遺伝子を標的として選定し、G-quadruplexの形成を誘導するStaple核酸の設計を行った。第一世代のStaple核酸は、4箇所のグアニン繰り返し配列を近接化させG4構造の形成を誘導するものだが、標的となる遺伝子は限られており、顕著なrG4形成を可能とする設計はできない。そこで、第二世代型のStaple核酸を設計し、Staple核酸側からグアニンの繰り返し配列を提供し、標的mRNA中に存在する2つのグアニン繰り返し配列を近接化させることでrG4を構築する方法を考案した 。
次に、rG4のプローブであるThioflavin-T（ThT）を利用して、第二世代型Staple核酸によるrG4形成誘導を確認した。その結果、グアニン繰り返し配列を提供するStaple核酸では、rG4の形成を示す蛍光シグナルの増大を確認することに成功した。これにより、試験管レベルにおいて、第二世代型Staple核酸がHIVに関連する遺伝子中でrG4の形成を誘導することが明らかになった 。
さらに、逆転写酵素の伸長反応阻害効果を利用する「StopAssay」を実施し、Staple核酸によるrG4形成が期待通りの位置で行われていることを確認した。この結果、HIV-1ウイルスにおける逆転写酵素の伸長反応を阻害することができることを証明した 。
次に、同遺伝子を標的としたタンパク質合成阻害評価をキャピラリーウエスタンブロットにて行った。Staple核酸はShort hairpin expression vectorを利用して細胞内で発現させ、rG4の形成による遺伝子発現抑制効果を確認した。エレクトロポレーションによる細胞導入では効果的な遺伝子発現抑制効果が認められたが、Transfection試薬を利用した場合は効果が見られなかった。これは、プロモーターの弱さに起因するものと考えられる。
最後に、Staple核酸を利用した転写阻害効果を検討した。DNAを標的とし、センス鎖およびアンチセンス鎖のどちらにG4構造の形成を誘導するかを検討した結果、アンチセンス鎖においてのみ転写阻害効果が発揮されることが明らかになった。
このように、第二世代型Staple核酸は、HIVに関連する遺伝子中でrG4の形成を誘導し、逆転写反応およびタンパク質合成を阻害することができた。