本研究では上記達成目標の元、確実な成果を得るため、①CANVAS_iPSCの感覚神経細胞、運動神経細胞への分化・解析、②CANVAS_iPSCのプルキンエ細胞への分化・解析、③NIID_iPSCの皮質神経細胞への分化・解析の順で優先してプロジェクトを進める方針としSCA27B_iPSCについては樹立を目的とする、としていた。
研究開発代表者はこれまでに臨床医として非翻訳領域リピート病の臨床的・遺伝学的研究を行う過程でCANVAS、NIID、SCA27B患者から臨床情報収集し、iPSC樹立に協力を得られる患者コホートを形成してきた。本研究ではこの患者コホートを利用し、当初の目標通りに疾患iPS細胞株を樹立した。CANVAS_iPSCはロングリードシーケンサーで、NIID_iPSC、SCA27B_iPSCについてはPCR法で細胞株樹立後、病的リピート伸長が保たれていることを確認した。さらに、その後の解析に利用するCANVAS_iPSC、NIID_iPSCは継代によってリピート数が変化しないこと、NIID_iPSC由来神経細胞は、神経細胞分化によりリピート数が変化しないことを確認し非翻訳領域リピート病解析にiPSCモデルが有用であることを示した。
これらiPSCを用いて、横浜市立大学内で皮質神経細胞、感覚神経細胞、運動神経細胞、プルキンエ細胞へ分化する培養技術・神経細胞分化誘導技術の確立を図った。当初令和6年6月に上記4系統の神経細胞分化技術の確立を目標とし、皮質神経細胞、感覚神経細胞、運動神経細胞については予定通り目標を達成したが、プルキンエ細胞は達成が遅れ、最終的には研究期間内の令和7年2月に達成した。
CANVAS_iPSCの表現型解析としてはCANVAS_iPSC由来感覚神経細胞においてRNA fociの検討を行い、ACAGG例のみでRNA foci形成を確認した。さらにRNA発現解析ではAAGGG症例、ACAGG症例ともにスプライシングの異常が起こること、両リピート伸長群で共通するパスウェイのスプライシング異常を確認した。NIID_iPSC由来皮質神経細胞の解析では核内封入体はほとんど検出されなかった。しかし、患者iPSC由来神経細胞ではスプライシングの異常が起こること、5’-UTR ATGをゲノム編集で除去したクローンでは患者iPSCで見られたスプライシング異常がキャンセルされることを見出し、スプライシング異常は封入体形成以前の早期の病態を反映している可能性が考えられた。NIID核内封入体のプロテオーム解析については培養細胞系でin situビオチン化抗体法を利用して行い、核膜輸送に関連するタンパク質、SUMO（Small ubiquitin like modifier）修飾関連タンパク質、RNAスプライシングに関連するRNA結合タンパク質を数多く同定した。また、合成mRNA法を用いてiPSC由来神経細胞の効率的な分化系を構築した。