本研究では、このSNA-MBを用いてin situで簡便かつ正確に遺伝子変異を識別し、実際の診断に応用することができるRNA検出技術の創製を目指した。これまでに他の研究グループからも様々な核酸検出Probeが提案されてきたが、多くの場合DNAを骨格とし、標的に対する結合力が不十分であること、及びバックグラウンド発光による検出感度の低さが問題となり、増幅等の複雑な前処理が必要になるなど点変異をはじめ遺伝子変異検出の実用化には至っていない。SNA-MBは従来のProbeとは異なり人工核酸であるSNAを骨格とすることでProbe性能が大幅に改善されているため、点変異を含むRNA配列の簡便かつ正確な検出が可能である。本研究では、臨床応用を目指し以下の研究開発を行った。
（１）：複数の遺伝子変異検出を目指したSNA-MBの開発
SMB-MBの最適化に関しては、これまでにSNA-MBに導入してきた蛍光色素(Perylene, Cy3)と干渉しない蛍光色素を導入したSNA-MBを設計し、また、これらの蛍光色素に対して適切な消光剤を探索した。新たな蛍光色素としてCy5を採用し、これに適した消光剤の検討を行った。このなかで、Cy5とBHQ2のペアを用いたSNA-MBは、配列にもよるがS/B = 20～130であった。バッファーの塩濃度や反応温度の最適化により、約2.5倍の蛍光強度向上を得ることができた。これらにより、vitroにて点変異を識別できることを確認した。さらに、組織検体の自家蛍光を考慮して、ROXを新たな蛍光色素として検討し、下述するデンドリマーにて採用した。これらの消光剤鎖として、BHQ2を採用し蛍光の抑制に成功した。
（２）：SNA-MBを用いた組織検体でのRNA検出
最大の課題は組織検体におけるSNA-MBや染色条件の最適化であった。組織検体は、ホルマリン固定されており、アルデヒドとアミンが結合してシッフ塩基を形成し、自家蛍光が生じることが報告されている。施設により固定時間が一定でなく、また、検体によっても固定時間にばらつきが存在する。さらに保存状況にも差があり、それらにより背景の自家蛍光に大きな差があることが判明した。CuSO4/AcONH4を用いることで自家蛍光を低減でき、さらに洗浄回数を増やすことでSNA-MBの非特異的な蛍光を低減することに成功した。しかしながら、実臨床に導入するためには、現状の感度（蛍光強度）では、判断に迷う症例が出る可能性が示唆されたため、蛍光強度を増強する必要があり、感度の向上を図るため、デンドリマーの導入を行った。これは競合技術の一つであるRNA scopeが、1RNAに対して20ヶ所の配列に対して検出を行うものの、当該技術では、1RNAに対して1ヶ所の配列に対してのみ検出を行うため、当該技術の蛍光強度が低くなると考えられること、さらに、RNA scopeでは、1ヶ所の配列に対してシグナルを増幅することで、蛍光強度の増強を図っていることが理由である。Native PAGEにて、高分子量の構造体の形成がされていることを確認し、RNA固定化ビーズを用いてデンドリマー形成効率が改善されたこと、また細胞株を用いた解析にて蛍光強度の増強されたことを確認した。しかし、このデンドリマーを組織検体に応用したところ、非特異蛍光の増強を認めた。原因を探索したところ、デンドリマーで用いた色素鎖が細胞や組織に非特異的に付着することで蛍光を発することが想定されたため、新たに消光剤鎖を導入し、これと細胞に付着した色素鎖を二重鎖形成させることで非特異蛍光のみ抑制することに成功した。これらにより、蛍光強度の増強に成功し1塩基変異を組織検体で同定することに成功した。これらにより、SNA-MBを用いた組織検体でのRNA検出が実臨床レベルでも可能であることを確認したが、さらなる蛍光強度の増強を目指すため、量子ドットを利用したプローブの設計にも着手している。量子ドットは、一分子で蛍光観測が可能であること、ストークスシフトが大きいことから蛍光物質の励起光と蛍光の発光が波長的に分離されるため、蛍光の観察が容易となり、特に自家蛍光との区別が容易になることが期待される。カルボン酸修飾された量子ドットを、アミン修飾された人工核酸であるL-aTNAに結合した新たなプローブの開発を現在行っている。
これらの結果を元に、肺がん遺伝子変異を検出するSNA-MBを組織検体に応用し、従来法の結果との関連の検討を開始した。倫理審査委員会承認の研究計画で保存された検体を用いて従来法としてオンコマイン Dx Target Test マルチ CDx システムを用いて、35名の患者検体の解析を行った。これらの解析によりALKやROS1、RETといった稀な遺伝子変異をもつ切除検体を同定することができた。さらに、研究同意のある検体のうち、日常臨床で得られた遺伝子変異結果をもつ検体を同定した。デンドリマーを用いた各種遺伝子解析用のSNA-MBの設計を行い、細胞株を用いてSNA-MBの最適化を開始したところである。
将来展望
本手法は、単純に標的核酸とprobeを結合させるという極めてシンプルな手法で解析が可能となり、簡易検査キットとして展開し、検査会社のみならず各病院での診断検査の標準化技術としても期待できる。解析に必要な時間の圧倒的な短縮化と、より検体量の少ない解析が可能になれば、患者にとっても大きなメリットとなると考えられる。さらに、肺がんのみならず、他癌腫へ展開することが可能と考えられ、患者のみならず臨床医にとっても有益と考えられる。
現在、デンドリマーを用いた各種遺伝子解析用のSNA-MBの設計を行い、細胞株を用いてSNA-MBの最適化を開始したところであるため、これらの最適化が終了次第、肺がん遺伝子変異を検出するSNA-MBを組織検体での従来法との関連を検討や、各種分子標的薬の耐性機序の解明、同様の遺伝子変異を有する他癌腫での遺伝子解析を行う予定としている。有用な結果が得られれば、肺がんをはじめ他癌種を含んだより大規模の臨床性能試験を行い、従来法と比較することによって、検査感度のみならず迅速性や検査における簡便性などを含む本手法の有用性を確認する。
本研究により、がん患者にとってより高感度の遺伝子変異の検出が可能となる診断薬を実用化でき、医療現場において変異頻度の低い腫瘍の遺伝子診断することが可能となると考えている。