がん免疫療法は有効性が証明されたがその効果は不十分で、より有用なバイオマーカーや治療開発が急がれる。体細胞変異に由来するネオ抗原は強い免疫応答を起こすが、その数を反映する全エクソンシークエンス(WES)による体細胞変異数（TMB）が効果予測バイオマーカーとして注目されている。一方で、エクソン領域の体細胞変異からの予測に基づくネオ抗原候補の多くは実際の免疫解析では反応せず、さらにTMBの効果予測精度も高くないため、真のネオ抗原を予測できていない可能性がある。また我々はこれまでにHLAクラスII（HLA-II）発現腫瘍の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の解析で腫瘍を攻撃する腫瘍特異的CD4陽性T細胞を同定したが、HLA-IIのネオ抗原はHLAクラスI（HLA-I）以上に不明な点が多い。近年、HLAリガンドームを用いることでlong noncoding RNA (lincRNA)由来ペプチドを含むHLAに提示されたペプチドを網羅的に解読することが可能となった。さらに従来のWESでは判読できない非エクソン領域の遺伝子配列を、ロングリードシークエンスにより同定が可能になった。そこでこれらを併用して従来法では抽出できない真のネオ抗原の網羅的な探索方法を確立し、HLA-Iだけでなく不明点が多いHLA-II/CD4陽性T細胞にまで応用してネオ抗原を再定義する目的で本研究を行なった。
まず我々は患者由来の腫瘍細胞株、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）およびTILのシングルセルシークエンスデータを同時に保有している固形がん患者から樹立した腫瘍細胞株を用いてロングリードシークエンスを行い、約7万の転写産物の同定に成功した。さらに免疫沈降とマススペクトロメトリーによりCryptic peptideの同定に成功した。これらの結果を照合することでMHC-I提示されたネオ抗原候補を網羅的に抽出した。次に、抽出したネオ抗原候補から作成したペプチドをpulseした患者由来腫瘍細胞株と腫瘍特異的なTCR配列を導入したJurkat細胞と共培養してその反応性を検証し、複数のネオ抗原ペプチドの同定に成功した。次に、HLA-IIに関してもHLA-Iと同様の検証を行ないネオ抗原候補を抽出し、in vitroでこれらをpulseした腫瘍細胞株と特異的CD4陽性T細胞クローン由来のTCRを導入したJurkat細胞とを共培養してHLA-IIに関しても真のネオ抗原の同定に成功した。
本研究により、新規技術を組み合わせた高精度のネオ抗原同定方法を確立する事ができ、従来精度が悪かったTMB以上の効果予測バイオマーカーを同定することが可能となり、今後の科学技術のイノベーション創出・新産業創出につながると考えられた。