負電荷を持たないオリゴヌクレオチド（中性ON）を構成するヌクレオシド素子の化学合成と中性ONの合成条件について検討した。中性ONの合成には、既知のヌクレオシド素子を用いたポストモディフィケーション法（代表者のこれまでの知見）と、新規に設計したヌクレオシド素子を利用したボトムアップ法が考えられるが、本研究ではプロセス開発を考慮し、後者の確立を進めた。市販のヌクレオシドの塩基部および糖部に適切な保護基を導入後、フェノール型ホスホロアミダイト試薬を作用させた。このものに対し、中性ONヌクレオシド素子を効率的に得る条件を探索した。得られた素子を用い、自動合成装置を用いた固相上での中性ON合成を検討した結果、ホスホロアミダイト法に基づく合成サイクルが適応可能であり、効率よく鎖伸長が進行することを確認した。また、5'-末端に蛍光標識を付与した中性ONを合成し、負電荷の解消に伴う細胞内取り込みの向上を予備的に確認した。一方、中性ONは分析条件下で化学変換を受けやすく、固相合成後の構造同定が困難という課題があり、別途、中性ONの液相および固液合成を実施してNMRによる正確な構造確認を行った。合わせて、液相合成による短鎖中性ONのも量的供給も可能となったため、これを用いた反復投与毒性試験（マウス）の準備を完了した。また、もう1つの課題として、中性ONからの代謝活性化が想定よりも早く進行する可能性が強く示唆されたことから、中性ONの代謝安定性を改善する化学構造の探索を行い、予備的ながら試験管内での代謝安定性向上を達成した。さらに、これらの課題の解決において見出した中性ONヌクレオチド素子の特異な化学反応性を活かし、当初計画以上の成果として、ONの新規合成法を確立した。
また、中性ON医薬の候補配列についても検証を行った。当初計画した配列は既存核酸医薬の配列を参考に設計したものであるが、両者は創薬アプローチが異なることから、検証実験においてオフターゲット毒性の発現リスクが強く示唆された。そこで、新規のオフターゲット毒性回避技術の開発に取り組み、開発した核酸医薬素子について、中性ONに先行して特許出願準備を進めた。
以上の成果を通じて、中性ONを利用する核酸医薬の高機能化を実現するための基盤技術を前進させることができた。