本事業は、小児で最も多い先天性代謝異常症であるミトコンドリア病の原因の一つであるmtDNAの変異そのものを標的とし、そのコピー数を減らすことにより根本的な治療法の開発を目指すことを目的として進めてきた。初年度から令和4年度にmtDNA変異で最も頻度が高いMELAS A3243G変異に対する候補化合物を主な標的化合物として創薬開発を進めてきた。千葉県がんセンターではリード候補薬物の合成スキームの確立と純度、生体内薬物動態、急性毒性、投与経路の評価を行なった。また、熊本大学と共同でMELAS患者由来iPS細胞を用いたMELASマウスモデルの作成が完了した。順天堂大学では、MELASマウスモデルでの変異遺伝子の細胞間水平伝搬の解析のための１細胞レベルミトコンドリアATAC-seq 手法の確立と検証を行った。順天堂大学と埼玉医科大学では本研究における候補化合物の対象となる可能性の高いA3243G変異を有する症例患者の確認と治験のためのプラットフォームの確立の準備を行った。熊本大学は、サポート機関として、MELAS患者からiPS細胞、神経幹細胞を樹立提供し、培養方法やMELASマウスモデルの確立にに対する助言を行った。

千葉県がんセンター
今年度は候補化合物の薬物動態、毒性や安全性を主に検討した。令和5年度には現在の候補化合物が10ミリグラムスケールで安定的に合成でき、台湾中央研究院生物化学研究所での解析で候補化合物は1H-31P HMQC NNMRなどの化合物同定法により一定程度の純度が確認された。GMPグレードを試作するため国内の数社のCMOと合成スケールアップに関わる化学的性質の同定・企業連携の相談を試み、コストが研究費より非常に高くなることが示唆されたが、GMPグレードの合成が可能と考えられた。また、MELAS患者由来でA3243G mtDNA変異を持つiPS細胞（熊本大学から供与）をNOGマウスに移植しMELASマウスモデルを作成した。当該マウスへの候補化合物の投与後の組織分布を検討し、脳を除くほとんどの組織および器官に候補化合物が送達されことを確認した。薬物動態試験を行い候補化合物はマウス静脈内投与後、血液から急速に消失し、尿中に排泄されることが観察された。また、静脈内投与に加えて、腹腔内、鼻腔内投与後の血液中にも候補化合物が検出されることを見出した。Axcelead Drug Discovery Partners株式会社に委託したCYP代謝試験によりCYP各分子種の阻害が認められないことが判った。さらに、マウスに単回および複数回投与した後に一般毒性が認められないことが血液生化学試験で確認された。PAMPAによる人工膜通過性アッセイPAMPA アッセイおよび Caco-2 アッセイにより、候補化合物の経口投与は適切でないことが示唆された。マウスの大槽内投与後、重篤な行動異常を起こすことなく脳組織に送達されることが観察されたことから、中枢神経系への投与経路として脳室内投与が想定された。連携したイギリスの製薬会社では、現在の候補化合物の投与により80％ヘテロプラスミーA3243G変異を持つサイブリッド細胞でミトコンドリア膜ポテンシャルの変動が独立に観察された。今後、さらなる毒性などの評価を検討したうえで、マウスおよびイヌの脳室内投与という非臨床試験に関わるプロトコールを作成し、PMDAと事前面談を行ったうえで、ステップ１へ繋げることを想定している。