新規バイオマーカーを用いた小児肝腫瘍のリキッドバイオプシー創出研究
研究課題情報
- 課題管理番号
- 23ama221403h0002
- 統合プロジェクト(二期)
医薬品プロジェクト<第二期>
- 事業名
次世代がん医療加速化研究事業
- タグ(2023)
研究開発目的: 診断に関する研究
研究の性格: 体外診断薬開発
研究モダリティ: その他
開発フェーズ: 応用
ICD-10大分類: 新生物<腫瘍>
対象疾患領域: がん , 成育
特記的事項: 研究倫理<ELSI/RRI等> , 国際共同研究
補足確認: 診断 , 治療
- タグ(2022)
研究の性格: 生命・病態解明等を目指す研究
開発フェーズ: 応用
承認上の分類: 体外診断薬
対象疾患: その他
疾患領域: がん
開発目的: 診断
- 代表研究機関
- 国立大学法人広島大学
- 研究代表者
(2023) 檜山英三, 国立大学法人広島大学, 自然科学研究支援開発センター・特任教授
(2022) 檜山英三, 国立大学法人広島大学, 自然科学研究支援開発センター・特任教授
- 研究期間
- 2022年度 - 2023年度
- 課題への総配分額
- 59,400 千円
- 研究概要(2023)
- 初年度に確立したβカテニン(CTNNB1)遺伝子異常とTERTプロモーター変異検出法を遊離核酸(ctDNA)に応用し、過去検体も含めて腫瘍の遺伝子点変異の検出率、化学療法中や腫瘍切除後の変異の消失、再発時の検出率を初年度に引き続き検討するとともに、新規患者の検体にも応用し、ターンアラウンドタイムも含めて検討し、リキッドバイオプシーとの診断法を確立する。さらに、遺伝子発現解析データとの統合、さらに全ゲノム解析データからの新規マーカーの解析も行い、臨床診断に適切なバイオマーカーの選定とその検査法を確立し、キット化を行う。さらに、肝芽腫の腫瘍、細胞株の細胞をシングルセルにしたものと、患者由来のCTC(すでに採取してナノスプレーチップに保存されているもの)を用いて初年度試みたグリピカン3やインドシアニングリーン(ICG)による採取法をもとに、ゲノミクス解析とセロミクス解析(MS解析)を行い、その相関を検討して、CTCのセロミクスデータを応用したリキッドバイオプシーについて検討する。
- 研究概要(2022)
- βカテニン(CTNNB1)遺伝子点変異の検出法を遊離核酸(ctDNA)に応用し、過去検体も含めて腫瘍の遺伝子点変異の検出率、化学療法中や腫瘍切除後の変異の消失、再発時の検出率を検討して、リキッドバイオプシーとしての有用性を検討する。肝細胞癌との移行型(TLCT, HCN-NOS)に特異的な血中の遊離核酸でのTERT遺伝子プロモーター領域のホットスポットである二カ所の点変異の検出法を確立する。さらに、メチル化遺伝子のメチル化についてctDNAで検出する検出法の検討し、次年度のキット化にむけて検出系を確立する。腫瘍由来のシングルセルと患者血液から分離採取したCTCを用いて、一細胞遺伝子解析(ゲノミクス解析)と一細胞解析セロミクスで、Wnt シグナルやとTERT蛋白、さらに他の代謝系について、同一患者由来のサンプルで検討し、CTC解析がどの程度腫瘍内代謝を反映しているかを解析する。
研究成果情報
2023
2022
成果の概要
keyboard_arrow_down
小児肝腫瘍において、高頻度にみられるβカテニン遺伝子(CTNNB1)変異の検出、悪性度の高いHCN-NOSのマーカーであるTERTプロモーターの変異検出法をddPCRで検出可能としたものを、小児では血漿から得られるctDNA量が限られることから、マルチカラーddPCRで両者を一度で検出可能とし、βカテニン点変異とTERTプロモーター領域変異検出法達成のマイルストーンが達成された。
メチル化を検討する遺伝子としている選別した5遺伝子(RASSF1A, OCIAD2, PARP6, MST1R,DLX6-AS1)に、その後のJPLT3試験症例にてメチル化アレイとパイロシークエンスの結果との相関を確認し、さらにddPCRの結果との相関も確認した。この5つのメチル化遺伝子を微量で迅速に判定するdigital droplet PCR(ddPCR)法による解析法を確立し、ctDNAのメチル化が腫瘍DNAのメチル化を反映し、リキッドバイオプシーとして応用可能なマーカーと位置づけた。これと並行して、収量の少ない検体を24ウェルのパイロシークエンシング解析PyroMark Q24で行うメチル化解析法も樹立し、これはddPCRデータの検証に有効で、メチル化遺伝子の分子マーカーの選別と評価法のマイルストーンを達成した。また、難治再発例等を層別するマーカー探索を実施し、DLX6-AS1メチル化(p-value<10-57)とほぼ同等の識別能を有する診断マーカーを18個の検討を加えた。さらに、遺伝子発現マーカーの探索の目的で、欧米で使用されているナノストリングシステムでの解析を行い、バイオマーカーとして有用な遺伝子発現マーカーを抽出した。
さらに、肝芽腫循環腫瘍細胞の採取法を検討し、肝芽腫細胞に高発現しているGlypican 3 (GPC3)に着目した蛍光活性化セルソーティング(FACS)による採取と肝芽腫細胞のIndocyanine Green (ICG)を取り込む性質に着目した蛍光顕微鏡下でのマニピュレーターを用いた採取の系を確立した。
メチル化を検討する遺伝子としている選別した5遺伝子(RASSF1A, OCIAD2, PARP6, MST1R,DLX6-AS1)に、その後のJPLT3試験症例にてメチル化アレイとパイロシークエンスの結果との相関を確認し、さらにddPCRの結果との相関も確認した。この5つのメチル化遺伝子を微量で迅速に判定するdigital droplet PCR(ddPCR)法による解析法を確立し、ctDNAのメチル化が腫瘍DNAのメチル化を反映し、リキッドバイオプシーとして応用可能なマーカーと位置づけた。これと並行して、収量の少ない検体を24ウェルのパイロシークエンシング解析PyroMark Q24で行うメチル化解析法も樹立し、これはddPCRデータの検証に有効で、メチル化遺伝子の分子マーカーの選別と評価法のマイルストーンを達成した。また、難治再発例等を層別するマーカー探索を実施し、DLX6-AS1メチル化(p-value<10-57)とほぼ同等の識別能を有する診断マーカーを18個の検討を加えた。さらに、遺伝子発現マーカーの探索の目的で、欧米で使用されているナノストリングシステムでの解析を行い、バイオマーカーとして有用な遺伝子発現マーカーを抽出した。
さらに、肝芽腫循環腫瘍細胞の採取法を検討し、肝芽腫細胞に高発現しているGlypican 3 (GPC3)に着目した蛍光活性化セルソーティング(FACS)による採取と肝芽腫細胞のIndocyanine Green (ICG)を取り込む性質に着目した蛍光顕微鏡下でのマニピュレーターを用いた採取の系を確立した。
学会誌・雑誌等における論文一覧
keyboard_arrow_down
1. Trobaugh-Lotrario A, Watanabe K, O'Neill AF, Dembowska-Baginska B, Haberle B, Murphy A, Hiyama E, Czauderna P, Meyers RL, Langham M, Feusner J. Second Malignant Neoplasms Following Treatment for Hepatoblastoma: An International Report and Review of the Literature. J Pediatr Hematol Oncol. 2024;46(2):80-7.10.1097/MPH.0000000000002824
2. Cho SJ, Ranganathan S, Alaggio R, Maibach R, Tanaka Y, Inoue T, Leuschner I, de Krijger R, Vokuhl C, Krailo M, Malogolowkin M, Meyers R, Czauderna P, Hiyama E, Ansari M, Morland B, Trobaugh-Lotrario A, O'Neill AF, Rangaswami A, Haberle B, Lopez-Terrada D. Consensus classification of pediatric hepatocellular tumors: A report from the Children's Hepatic tumors International Collaboration (CHIC). Pediatr Blood Cancer. 2023:e30505. 10.1002/pbc.30505
3. Kojima M, Hiyama E. Circulating Tumor Cells and Tumor Progression, Metastasis, and Poor Prognosis in Patients With Neuroblastoma. Anticancer Res. 2023;43(10):4327-31. 10.21873/anticanres.16627
4. Trobaugh-Lotrario AD, Maibach R, Aronson DC, Rangaswami A, Haberle B, O'Neill AF, Schmid I, Ansari M, Hishiki T, Ranganathan S, Alaggio R, de Krijger RR, Tanaka Y, Cho SJ, Vokuhl C, Maxwell R, Krailo M, Hiyama E, Czauderna P, Finegold M, Feusner JH, Malogolowkin MH, Meyers RL, Lopez-Terrada D. Outcomes of Patients Treated for Hepatoblastoma with Low Alpha-Fetoprotein and/or Small Cell Undifferentiated Histology: A Report from the Children's Hepatic Tumors International Collaboration (CHIC). Cancers (Basel). 2023;15(2). 10.3390/cancers15020467
5. Kato Y, Fukazawa T, Tanimoto K, Kanawa M, Kojima M, Saeki I, Kurihara S, Touge R, Hirohashi N, Okada S, Hiyama E. Achaete-scute family bHLH transcription factor 2 activation promotes hepatoblastoma progression. Cancer Sci. 2024. 10.1111/cas.16051
6. O'Neill AF, Trobaugh-Lotrario A, Geller JI, Hiyama E, Watanabe K, Aerts I, Fresneau B, Toutain F, Sullivan MJ, Katzenstein HM, Morland B, Branchereau S, Zsiros J, Maibach R, Ansari M. The RELIVE consortium for relapsed or refractory pediatric hepatoblastoma and hepatocellular carcinoma: a scoping review of the problem and a proposed solution. EClinicalMedicine. 2024;69:102446. 10.1016/j.eclinm.2024.102446
7. Pire A, Hirsch TZ, Morcrette G, Imbeaud S, Gupta B, Pilet J, Cornet M, Fabre M, Guettier C, Branchereau S, Brugieres L, Guerin F, Laithier V, Coze C, Nagae G, Hiyama E, Laurent-Puig P, Rebouissou S, Sarnacki S, Chardot C, Capito C, Faure-Conter C, Aerts I, Taque S, Fresneau B, Zucman-Rossi J. Mutational signature, cancer driver genes mutations and transcriptomic subgroups predict hepatoblastoma survival. Eur J Cancer. 2024;200:113583. 10.1016/j.ejca.2024.113583
8. Fujiyoshi S, Honda S, Ara M, Kondo T, Kobayashi N, Taketomi A. SGLT2 is upregulated to acquire cisplatin resistance and SGLT2 inhibition reduces cisplatin resistance in hepatoblastoma. J Hepatobiliary Pancreat Sci. 2024 Apr;31(4):223-233. doi: 10.1002/jhbp.1391. PMID: 37927142.
9. Morihiro K, Morita S, Harada N, Baba M, Yum J, Naito M, Miyata K, Nagae G, Okamoto A. RNA Oncological Therapeutics: Intracellular Hairpin RNA Assembly Enables MicroRNA-Triggered Anticancer Functionality. J Am Chem Soc, 2024, 146, 1346-1355, doi: 10.1021/jacs.3c09524.
10. Neyazi S, Yamazawa E, Hack K, Tanaka S, Nagae G, Kresbach C, Umeda T, Eckhardt A, Tatsuno K, Pohl L, Hana T, Bockmayr M, Kim P, Dorostkar MM, Takami T, Obrecht D, Takai K, Suwala AK, Komori T, Godbole S, Wefers AK, Otani R, Neumann JE, Higuchi F, Schweizer L, Nakanishi Y, Monoranu CM, Takami H, Engertsberger L, Yamada K, Ruf V, Nomura M, Mohme T, Mukasa A, Herms J, Takayanagi S, Mynarek M, Matsuura R, Lamszus K, Ishii K, Kluwe L, Imai H, von Deimling A, Koike T, Benesch M, Kushihara Y, Snuderl M, Nambu S, Frank S, Omura T, Hagel C, Kugasawa K, Mautner VF, Ichimura K, Rutkowski S, Aburatani H, Saito N, Schüller U. Transcriptomic and epigenetic dissection of spinal ependymoma (SP-EPN) identifies clinically relevant subtypes enriched for tumors with and without NF2 mutation. Acta Neuropathol, 2024, 147, 22, doi: 10.1007/s00401-023-02668-9.
学会・シンポジウム等における口頭・ポスター
keyboard_arrow_down
1. Methylation biomarkers in hepatoblastoma. Eiso Hiyama, Keynote lecture, 4th International Pediatric Liver Tumor Research Meeting, 2023/5/5, 国外, 口頭.
国外 / 口頭
2. 小児肝腫瘍に対する ICG ナビゲーション手術法の有効性を検証するための後方視的臨床研究,Sho Kurihara, Shohei Honda, Akiko Yokoi, Naonori Kawakubo, Norihiko Kitagawa, Yuichi Takama, Yoji Sasahara, Yohei Yamada, Tomoro Hishiki, Eiso Hiyama,第65回日本小児血液・がん学会学術集会, 2023/9/29, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
3. Progress toward liquid biopsy using cell-free DNA in hepatoblastoma. Award session, Eiso Hiyama. SIOP 2023 meeting 2023/10/13, 国外, 口頭.
国外 / 口頭
4. Outcome of a nationwide multicenter phase II clinical trial for localized hepatoblastoma: Report from Japan Children’s Cancer Group Liver Tumor Committee trial, JPLT3-S,I. Tomoro Hishiki, Kohmei Ida, KenichiroWatanabe, Makiko Mori, Michihiro Yano, Junya Fujimura, Yuki Nogami, Tomoko Iehara, Ken Hoshino, Akiko Yokoi, Takeshi Inoue, Yukichi Tanaka, Osamu Miyazaki, Tetsuya Takimoto, Kenichi Yoshimura, Eiso Hiyama. SIOP 2023 meeting 2023/10/11-14, 国外, 口頭.
国外 / 口頭
5. Pediatric Hepatic International Tumors Trial (PHITT) in Asia, Eiso Hiyama, 第61回日本癌治療学会学術集会, 2023/10/20, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
6. Clinical Trials for Childhood Liver Tumors, Eiso Hiyama, The 6th Oriental Congress of Pediatrics, 2023/12/9, 国外, 口頭
国外 / 口頭
7. 肝芽腫転移巣切除におけるICG蛍光法の活用, 栗原 將, 藤解 諒, 児島 正人, 佐伯 勇, 檜山 英三, 高橋 信也, 第188回広島外科会総会 第44回日本臨床外科学会広島県支部学術集会, 2024/3/2, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
8. 小児肝腫瘍に対するddPCRをベースとしたリキッドバイオプシーの試み.檜山 英三, 永江 玄太, 本多 昌平, 栗原 將, 兒島 正人. 第8回Liquid Biopsy 研究会, 2024/2/3, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
9. HCN NOS(Hepatocellular neoplasm not otherwise specified)の2例, 本多 昌平、河原 仁守、近藤 享史、荒 桃子、河北 一誠、長津 明久、柿坂 達彦、寺下友佳代、真部 淳、高桑 恵美、武冨 紹信, 第61回日本小児外科学会学術集会 2023/6/1, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
10. 臨床応用を目指したDNAメチル化解析に基づく肝芽腫予後層別化の検討, 本多昌平, 近藤享史, 河原仁守, 奥村一慶, 荒 桃子, 河北一誠, 鈴木 拓, 武冨紹信, 第126回北海道癌談話会シンポジウム 2023/7/8, 国内, 口頭
国内 / 口頭