結核コホート研究より得られた結核菌ゲノム構造変異、可動遺伝因子とリピート配列の役割と病原性
研究課題情報
- 課題管理番号
- 22wm0225011h0003
- 統合プロジェクト（二期）
疾患基礎研究プロジェクト<第二期>
- 事業名
新興・再興感染症研究基盤創生事業
- タグ（2022）
研究の性格： 生命・病態解明等を目指す研究
開発フェーズ： 基礎的
承認上の分類： 医薬品
対象疾患： その他
疾患領域： 感染症
開発目的： 予防・健康 , 診断 , 治療
- タグ（2021）
研究の性格： 生命・病態解明等を目指す研究
開発フェーズ： 基礎的
承認上の分類： 医薬品
対象疾患： その他
疾患領域： 感染症
開発目的： 予防・健康 , 診断 , 治療
- タグ（2020）
研究の性格： 予防のためのエビデンス構築を目指す研究<疫学を含む>
開発フェーズ： 基礎的
対象疾患： その他
疾患領域： 感染症
開発目的： 予防・健康 , 診断 , 治療
- 代表研究機関
- 公益財団法人結核予防会結核研究所
- 研究代表者
(2022) 慶長直人, 公益財団法人結核予防会結核研究所, 副所長
(2021) 慶長直人, 公益財団法人結核予防会結核研究所, 副所長
(2020) 慶長直人, 公益財団法人結核予防会結核研究所, 副所長
- 研究期間
- 2020年度 - 2022年度
- 課題への総配分額
- 67,600 千円
- 研究概要（2022）
- 慶長:1,2年度で集積された検体について、薬剤耐性、高伝播性などの表現型について、分担研究者より得られた結核菌構造変異の全リストを用いたゲノムワイド関連解析を行う。臨床疫学的危険因子を合わせて解析する。土方:ハノイから輸入された結核菌株の追加シークエンスを行い、完全長配列決定株を増やす。得られた完全長配列をパネル化してコホート株ゲノム構造変異のリストを作成し、病態と関わる構造変異の検出系を作成する。瀬戸:本研究において、結核コホート研究によって明らかにした結核菌ゲノムDNAの構造変異によって破壊、制御される遺伝子機能を、ヒト活動性結核を反映していると考えられているマウスモデルを用いて検証する。構造変異が認められた臨床分離株をヒト結核マウスモデルに感染させて、感染組織のオミックス解析を行い、構造変異によって破壊、制御される遺伝子機能を評価する。
- 研究概要（2021）
- 治療歴のない活動性肺結核396名のコホート研究を継続し、10年前の既報との比較を行う。ハノイ市にまん延する東アジア系統 (L2、北京型)、インドオセアニア系統 (L1、EAI4ベトナム型)、および欧米系統 (L4)の亜系統の広がりが10年間でどのように変化しているか、全ゲノム変異を用いた系統解析により明らかにする。1年度目にハノイから輸入された結核菌株、継続コホート研究で収集された株を中心にシークエンスを行い、完全長配列決定株を増やす。得られた完全長配列をパネル化してコホート株ゲノム構造変異のリストを作成する。本研究において、結核コホート研究によって明らかにした結核菌ゲノムDNAの構造変異によって破壊、制御される遺伝子機能を、ヒト活動性結核を反映していると考えられているマウスモデルを用いて検証する。embR2遺伝子などの遺伝子欠損株をC3HeB/FeJマウスに感染させて、感染組織のオミックス解析を行い、構造変異によって破壊、制御される遺伝子機能を評価する。
- 研究概要（2020）
- 慶長:治療歴のある活動性肺結核患者計546名に関する、継続中のコホート研究を対象に臨床疫学データを取得する。短鎖シークエンス法(イルミナ社)でゲノムワイドに配列データを取得する。再治療前と再々治療時の薬剤耐性プロフィールを比較し、ゲノム上の薬剤耐性関連変異のパターンを比較する。また、再排菌が再発なのか再感染なのか、菌の遺伝的類似度を明らかにする。土方:ハノイ市結核コホートにおいて収集された結核菌ゲノムDNAを用い、臨床疫学データよりハノイ市の薬剤耐性や伝播状況を代表する臨床分離株を選定し、我々の施設で所有するGridION(ONT社)で80株以上の長鎖ゲノムシークエンスを行い、短鎖データと合わせて高精度な結核菌ゲノム完全長配列を取得する。瀬戸:本研究において、結核コホート研究によって明らかにした結核菌構造変異によって破壊、制御される遺伝子機能を、ヒト活動性結核を反映していると考えられているマウスモデルを用いて検証する。embR2遺伝子などの遺伝子欠損株をC3HeB/FeJマウスに感染させて、感染組織における乾酪壊死形成、空洞形成への関与について明らかにする。
研究成果情報
2022
2021
2020
成果の概要
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ハノイ市にまん延する第2系統（北京型）を中心とする結核菌系統樹から選択した、代表的結核菌30株のPacBio HiFiシークエンスによる完全長配列データを用いて、ナノポアシークエンサーにより得られた配列データの不完全部分を補完した。また完全長配列から、第2系統（北京型）の結核菌では、病原性との関連が示唆される可動遺伝因子であるIS6110を他の系統よりも有意に多く保持していることを示した。（慶長)
特に結核菌ゲノム配列同定の際に用いられるH37Rv株の参照配列には存在しないため、しばしば解析対象から外されるembR2遺伝子の存在による臨床疫学的特徴と機能に注目して検討を進めた（各分担研究者）。
研究期間全体で287株となった結核菌ゲノム完全長配列の解析を行い、ベトナムハノイ市にまん延拡大している北京型結核菌亜群に特徴的な解析困難なリピート配列であるPE/PPE遺伝子群を含む構造変異を明らかにした。また、我々が開発した配列解析ツールであるRepUnitTyping (Maeda S, et al. Infect Genet Evol.)を用いて、同亜群の簡便な判定法を作成した。（土方）
単離された臨床分離株をヒトTHP-1マクロファージ細胞および結核マウスモデルC3HeB/FeJに感染させて、これらの菌株によるマクロファージおよび生体への免疫反応を明らかにした。また、菌株の培養条件によってヒトマクロファージへの免疫反応が変化することを実験株および臨床分離株を用いて明らかにした。（瀬戸）
embR2遺伝子を持つ結核菌株の特徴を明らかにするため、CRISPR-Cas9システムで転写制御因子であるembR2遺伝子破壊株、及び相動性が高く同様な機能があると推定されるembR遺伝子破壊株を作製した。（前田）
ベトナム結核コホート研究の各クラスター代表臨床分離25株について脂質分子の偏在性を比較検討した。embR2遺伝子の関与が指摘されるフチオセラン酸ジマイコセロセート（PDIM）、フェノール糖異質（PGL）、リポマンナン（LM）、リポアラビノマンナン（LAM）の表現型を比較した。臨床分離株、作製したembR2遺伝子欠失株では、解析範囲内では、embR2遺伝子とPGL, PDIMの発現に相関は認めていないため、LM, LAMの評価方法をさらに検討中である。また、薬剤耐性率が顕著で伝播力が強力なSクラスター株はPDIM近辺の脂質発現パターンが他株と異なっていたため、詳細な脂質解析を継続している。（藤原）
特に結核菌ゲノム配列同定の際に用いられるH37Rv株の参照配列には存在しないため、しばしば解析対象から外されるembR2遺伝子の存在による臨床疫学的特徴と機能に注目して検討を進めた（各分担研究者）。
研究期間全体で287株となった結核菌ゲノム完全長配列の解析を行い、ベトナムハノイ市にまん延拡大している北京型結核菌亜群に特徴的な解析困難なリピート配列であるPE/PPE遺伝子群を含む構造変異を明らかにした。また、我々が開発した配列解析ツールであるRepUnitTyping (Maeda S, et al. Infect Genet Evol.)を用いて、同亜群の簡便な判定法を作成した。（土方）
単離された臨床分離株をヒトTHP-1マクロファージ細胞および結核マウスモデルC3HeB/FeJに感染させて、これらの菌株によるマクロファージおよび生体への免疫反応を明らかにした。また、菌株の培養条件によってヒトマクロファージへの免疫反応が変化することを実験株および臨床分離株を用いて明らかにした。（瀬戸）
embR2遺伝子を持つ結核菌株の特徴を明らかにするため、CRISPR-Cas9システムで転写制御因子であるembR2遺伝子破壊株、及び相動性が高く同様な機能があると推定されるembR遺伝子破壊株を作製した。（前田）
ベトナム結核コホート研究の各クラスター代表臨床分離25株について脂質分子の偏在性を比較検討した。embR2遺伝子の関与が指摘されるフチオセラン酸ジマイコセロセート（PDIM）、フェノール糖異質（PGL）、リポマンナン（LM）、リポアラビノマンナン（LAM）の表現型を比較した。臨床分離株、作製したembR2遺伝子欠失株では、解析範囲内では、embR2遺伝子とPGL, PDIMの発現に相関は認めていないため、LM, LAMの評価方法をさらに検討中である。また、薬剤耐性率が顕著で伝播力が強力なSクラスター株はPDIM近辺の脂質発現パターンが他株と異なっていたため、詳細な脂質解析を継続している。（藤原）
学会誌・雑誌等における論文一覧
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1. Hikichi H, Seto S, Wakabayashi K, Hijikata M, Keicho N. Transcription factor MAFB controls type I and II interferon response-mediated host immunity in Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages. Front Microbiol. 2022, 13:962306. doi: 10.3389/fmicb.2022.962306.
2. Seto S, Nakamura H, Guo TC, Hikichi H, Wakabayashi K, Miyabayashi A, Nagata T, Hijikata M, Keicho N, Spatial multiomic profiling reveals the novel polarization of foamy macrophages within necrotic granulomatous lesions developed in lungs of C3HeB/FeJ mice infected with Mycobacterium tuberculosis. Front Cell Infect Microbiol. 2022, 12:968543. doi: 10.3389/fcimb.2022.968543.
3. Furuuchi K, Seto S, Nakamura H, Hikichi H, Miyabayashi A, Wakabayashi K, Mizuno K, Oka T, Morimoto K, Hijikata M, Keicho N. Novel Screening System of Virulent Strains for the Establishment of a Mycobacterium avium Complex Lung Disease Mouse Model Using Whole-Genome Sequencing. Microbiol Spectr. 2022, 10(3):e0045122. doi: 10.1128/spectrum.00451-22.
4. びまん性汎細気管支炎, 慶長直人, 今日の治療指針(Vol.65）, 医学書院, 2023, 298-299.
5. 3.原因・併存疾患ごとの気管支拡張症の病態H.原発性線毛運動不全症（PCD）,慶長直人, 森本耕三, 気管支拡張症Up to Date, 南江堂, 2022, 71-76.
6. 3.原因・併存疾患ごとの気管支拡張症の病態G.びまん性汎細気管支炎（DPB）,土方美奈子,慶長直人,気管支拡張症Up to Date, 南江堂, 2022, 67-70.
7. Bailo R, Radhakrishnan A, Singh A, Nakaya M, Fujiwara N, Bhatt A. The mycobacterial desaturase DesA2 is associated with mycolic acid biosynthesis. Sci Rep. 2022 Apr 28;12(1):6943. doi: 10.1038/s41598-022-10589-y.
8. Mizutani T, Ano T, Yoshioka Y, Mizuta S, Takemoto K, Ouchi Y, Morita D, Kitano S, Miyachi H, Tsuruyama T, Fujiwara N, and Sugita M. Neutrophil S100A9 supports M2 macrophage niche formation in granulomas. iScience. 2023, Jan 31;26(3):106081, doi: 10.1016/j.isci.2023.106081. 10.1016/j.isci.2023.106081 10.1016/j.isci.2023.106081. eCollection 2023 Mar 17.PMID: 36843852
9. Fujiwara, N. 2022. Anticancer immunotherapeutics: mycoloyl glycolipids and lipoglycan in the cell wall, p. 193-212 (Chapter IV, 13). In T. Takii, J. Maeyama, S. Yamamoto (ed.), BCG 2nd Edition -TB vaccine- Application against tuberculosis and other diseases. Japan Anti-Tuberculosis Association, Tokyo. ISBN:978-4-87451-321-7.
10. 藤原永年．2022.1.15．世界の結核研究の動向(26) 結核菌に特徴的な脂質分子と宿主応答．複十字 402号 P.20-22. 公益財団法人結核予防会発行
学会・シンポジウム等における口頭・ポスター
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1. 潜在性結核感染～科学的視点から, 慶長直人, 第97回結核・非結核性抗酸菌症学会総会・学術集会, エキスパートセミナー7, 旭川, 2022/7/1-2, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
2. ベトナム医療従事者における宿主 PRKAG2遺伝子多型と潜在性結核感染症, 宮林亜希子, 若林佳子, 土方美奈子, 瀬戸真太郎, 慶長直人, 第97回結核・非結核性抗酸菌症学会総会・学術集会, 旭川, 2022/7/1-2, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
3. 抗酸菌の潜在状態における免疫調節, 土方美奈子, 瀬戸真太郎, 慶長直人, 第97回結核・非結核性抗酸菌症学会総会・学術集会, 旭川, 2022/7/1-2, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
4. オミックス解析による活動性結核マウスモデルにおける泡沫化マクロファージ形成の解析, 瀬戸真太郎,中村 創,引地遥香,土方美奈子, 慶長直人, 第97回結核・非結核性抗酸菌症学会総会・学術集会, 旭川, 2022/7/1-2, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
5. 低酸素環境における結核菌感染マクロファージの遺伝子発現解析, 引地遥香, 瀬戸真太郎, 土方美奈子, 慶長直人, 第97回結核・非結核性抗酸菌症学会総会・学術集会, 旭川, 2022/7/1-2, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
6. 結核菌感染ヒトマクロファージ細胞における SP110 、SP140 遺伝子の RNA シークエンシ ングによる機能解析, 中村創,瀬戸真太郎,土方美奈子,慶長直人,第97回結核・非結核性抗酸菌症学会総会・学術集会, 旭川, 2022/7/1-2, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
7. 肺 Mycobacterium avium complex症マウスモデル構築を容易にする臨床分離株選択システムの開発, 古内浩司, 瀬戸真太郎, 中村創, 引地遥香, 宮林亜希子, 若林佳子, 水野和重, 森本耕三, 土方美奈子, 慶長直人,第97回結核・非結核性抗酸菌症学会総会・学術集会, 旭川, 2022/7/11-12, 国内, 口頭.
国内 / 口頭
8. 結核感受性に関与する転写因子 MafB による結核肉芽腫形成の制御，引地遥香，中村 創，瀬戸真太郎，土方美奈子，慶長直人，第96回日本細菌学会総会，2023/3/16-18，国内，ポスター
国内 / ポスター
9. 空間的マルチオミックスで探索する結核肉芽腫における泡沫化マクロファージのバイオマーカー，瀬戸真太郎，土方美奈子，慶長直人，第96回日本細菌学会総会，2023/3/16-18，国内，口頭，ポスター
国内 / 口頭
10. Mycobacterium intracellulare ku11株由来glycopeptidolipidの構造と糖鎖合成遺伝子の解析，前田伸司，中屋愼，山田博之，山本三郎，藤原永年，宮本友司，中崇，綾田稔，第97回日本結核・非結核性抗酸菌症学会，旭川，2022/07/01，国内，口頭
国内 / 口頭