本研究計画では、現在耐性菌の増加で問題となっているCandida glabrataやC. auris等のNon-albicans Candida属真菌に対応する抗真菌薬の開発を目指している。歴史的に細胞膜は抗真菌薬の標的として重要性が証明されており、我々は細胞膜脂質成分の合成酵素であるErg25に着目してきた。真菌においてERG25遺伝子はCandida属で相同性が高く、遺伝子欠損は致死となり、ヒトタンパク質とのアミノ酸配列の相同性が低いため抗真菌薬の標的として有望であることを前期ステージにおいて証明した。本ステージでは、ERG25阻害剤スクリーニング方法と評価法を開発することを目的としている。令和2年度は、ERG25阻害剤スクリーニング方法の１つとして計画しているERG25をパーシャルノックダウンすることにより阻害剤に対する高感受性化するための方法の条件を決定した。次にSaccharomyces cerevisiaeの高発現ベクターにC. glabrataとC. aurisのERG25遺伝子を挿入したノックイン酵母を作製した。ヒトERG25遺伝子のノックイン酵母は既に作製済みである。これらの酵母の抽出液を用いて無細胞状態でErg25の真菌阻害効果と選択阻害効果を検証することが可能になった。令和3年度は、Erg11とErg25の抑制相殺効果を利用したアッセイ系を構築した。セルフリーアッセイ系については基質の前処理を検討し酵素活性の感度を向上させた。C. glabrataを感染させたマウスを用いたin vivoアッセイ系の構築では、免疫抑制剤の投与方法を検討した結果、MCFG投与によって生存率を上昇させることができた。さらに、ヒト細胞への副反応を検出するためにリピドミクス解析系を構築した。令和4年度は、スクリーニングアッセイ系についてErg25の阻害剤を用いて検証した。構築したアッセイ系により大阪大学創薬サイエンス研究支援拠点から供与を受けた1,370化合物を用いてフィージビリスタディーを実施した。その結果、Erg25の阻害剤は検出されなかったものの、ポジティブコントロールとしてライブラリーに含まれていたテトラサイクリン系薬剤の3薬剤を全て検出し、偽陽性は検出されず本アッセイ系の高感度、高信頼度を示すことができた。また、同フィージビリスタディーでは1/20 (5µl)へのスケールダウンにも対応することに成功し、384穴や1,536穴のマイクロプレートへの対応が可能であることが示された。さらに、セルフリーアッセイ系としてヒトErg25遺伝子をノックインした酵母を用いて標的である酵素の活性を確認した。マウスを用いたin vivoアッセイ系については、免疫抑制剤を投与する基準を設けた。