本研究では、薬剤環境下における細菌の持続性メカニズムの特定を目指し、大腸菌一遺伝子欠失株ライブラリASKA barcode collectionを用いたBar-seqハイスループットシーケンシングによる集団ダイナミクス変動の検出と、持続性変異株の特定、及び一細胞レベルでの生育の観察を行った。令和4年度は、前年度にASKA barcode collectionのシプロフロキサシン処理・時系列サンプリング・bar-seqシーケンシングによるダイナミクスの検出によって特定された、持続性表現型を示す候補株について、さらなる検証実験を行なった。その結果、以下の成果が得られた。
・Bar-seq解析による網羅的持続性データの信頼性の確認
これまでにも網羅的な欠失株ライブラリを用いて持続性株を特定する試みは行われてきたが、持続性検出手法の制約により、持続性レベルの時系列変化を網羅的に検出することは困難であった。Bar-seq解析によって得られた、特徴的な薬剤持続性の推移を示した株について個別に検証したところ、ほとんどの株について、網羅的検出で得られた持続性のパターンが再現された。このことにより、網羅的持続性データの信頼性が確認された。
・高持続性・低持続性株の薬剤耐性度測定による新規知見
薬剤持続性と薬剤耐性の関係を探るため、網羅的解析で得られた高持続性・低持続性株について、MIC(最小発育阻止濃度)を測定した。その結果、低持続性株は必ずしも薬剤感受性ではないが、低持続性株の中で薬剤感受性を示した株は薬剤処理開始直後から著しく持続性集団が減少すること、また、高持続性株にも野生株と比べて高い感受性を持つ例が見つかった。
・高持続性株のメカニズム検証
得られた高持続性株は内膜薬剤排出ポンプの遺伝子を欠失した株であった。候補遺伝子と外膜チャネルタンパク質遺伝子の両方を欠失した株の持続性を検証した結果、高持続性表現型が確認された。また、シプロフロキサシンに蛍光を付与した抗生物質を用いて薬剤排出機能の欠損を確認したところ、候補株は野生株に比べて非常に高い蛍光強度を示したことから、薬剤排出能の低下した株であることが確認された。（令和５年度への研究期間延長による成果）
・成果論文発表
英国側共著者へ共有し確認中であり、投稿に向けて準備中である。