本年度は階層的血管構造を有する組織再構成に向け、以下の研究項目について検討を実施した。

1. 異なる階層の血管（細小動静脈・毛細血管）を有する再構成肝組織の作製
2. ヒトiPSC由来大血管再構成法の開発
3. 血管吻合移植可能な大血管付与再構成肝組織の開発

1. 昨年度までにhiPSC由来門脈血管内皮細胞（EC）とhiPSC由来静脈ECの開発に成功している。肝臓中で門脈周囲の肝細胞と中心静脈周囲の肝細胞において異なる代謝能が認められており、Liver Zonationと呼ばれる。例えば、門脈周辺では糖新生が活発に生じ、中心静脈周辺では脂質合成や解糖系が働く。Liver zonationの成立には、中心静脈内皮からのシグナルが重要であることが知られる。本年度は、門脈・中心静脈マーカータンパク質をhiPSC-肝臓オルガノイド（LO）培養系に添加することにより、門脈・中心静脈周囲に存在する肝細胞を特徴づける遺伝子群の発現上昇を認め、Zonation形成を促進する培養条件に関する端緒的データを得た。
2, 昨年度までに、血管新生誘導因子の添加によるhiPSC大血管からの血管内皮細胞の遊走促進効果が認められている。そこで、今年度はhiPSC大血管とhiPSC-LO内血管との連結に向けた検討を実施した。hiPSC大血管とhiPSC-LOの共培養から約一週間後時点において、hiPSC-LO組織内への大血管由来の血管内皮細胞の遊走が生じることを明らかにした。
3. 昨年度までにヒトiPSC大血管付与hiPSC-LOの還流培養系を構築し、還流培養による組織増大やアルブミン分泌の増加が認められている。今年度は、上記に加えて還流培養群においてアルブミン以外の複数の機能タンパク質の分泌量増加、アンモニア代謝能・尿素産生の亢進を認めた。また、肝臓発生において報告されている還流刺激による組織増殖誘導機構が、我々の開発したヒトiPSC大血管付与hiPSC-LOの還流培養系においても認められた（Lorenz et al., Nature, 2018）。さらに、ヒトiPSC大血管作製に用いる人工血管用材料の改良を行い、ラット大腿動脈へのヒトiPSC大血管付与hiPSC-LOの血管吻合移植に成功した。移植直後に、hiPSC-LO内血管に即座に血流が生じることが確認された。移植１週間後にラット血中におけるヒトアルブミンが検出され、hiPSC肝組織内の肝細胞でCYP3A4、A1ATなど複数の肝機能関連タンパク質の発現が認められたことから、in vivoにおけるhiPSC-LOの機能が確認された。