ブラジルと日本の薬剤耐性を含む真菌感染症診断に関する研究とリファレンス協力体制強化
研究課題情報
- 課題管理番号
- 21jm0110015h0006
- 統合プロジェクト（二期）
シーズ開発・研究基盤プロジェクト<第二期>
- 9つの連携分野プロジェクト
その他<第一期>
- 事業名
医療分野国際科学技術共同研究開発推進事業
- タグ（2021）
研究の性格： 新規診断法・検査法・検査体制の開発、確立、検証<診断薬・診断機器開発は除く>
開発フェーズ： 応用
承認上の分類： 体外診断薬
対象疾患： その他
疾患領域： 感染症
開発目的： 診断 , 治療
- タグ（2020）
研究の性格： 医療技術・標準治療法の確立等につながる研究<診療の質を高めるためのエビデンス構築<診療ガイドライン作成等>を含む>
開発フェーズ： 基礎的
対象疾患： その他
疾患領域： 感染症
開発目的： 予防・健康 , 診断 , 生活の質<QOL>
- タグ（2019）
研究の性格： 調査等の解析による実態把握を目指す研究<フィールドワーク、サーベイランス、モニタリングを含む>
開発フェーズ： 該当なし
承認上の分類： 薬機法分類非該当
対象疾患： 感染症および寄生虫症
- タグ（2018）
研究の性格： 新規診断法・検査法・検査体制の開発、確立、検証<診断薬・診断機器開発は除く>
開発フェーズ： 該当なし
承認上の分類： 薬機法分類非該当
対象疾患： 感染症および寄生虫症
- タグ（2017）
研究の性格： 医療技術・標準治療法の確立等につながる研究<診療の質を高めるためのエビデンス構築<診療ガイドライン作成等>を含む>
開発フェーズ： 該当なし
承認上の分類： 薬機法分類非該当
対象疾患： 感染症および寄生虫症
- タグ（2016）
研究の性格： 新規診断法・検査法・検査体制の開発、確立、検証<診断薬・診断機器開発は除く>
開発フェーズ： 該当なし
承認上の分類： 薬機法分類非該当
対象疾患： 感染症および寄生虫症
- 代表研究機関
- 国立大学法人千葉大学
- 研究代表者
(2021) 渡邉哲, 国立大学法人千葉大学, 真菌医学研究センター臨床感染症分野 准教授
(2020) 渡邉哲, 国立大学法人千葉大学, 真菌医学研究センター臨床感染症分野 准教授
(2019) 渡邉哲, 国立大学法人千葉大学, 真菌医学研究センター 臨床感染症分野 准教授
(2018) 渡邉哲, 国立大学法人千葉大学, 真菌医学研究センター臨床感染症分野 准教授
(2017) 渡邉哲, 国立大学法人千葉大学, 真菌医学研究センター臨床感染症分野 准教授
(2016) 渡邉哲, 国立大学法人千葉大学, 真菌医学研究センター 准教授
- 研究期間
- 2016年度 - 2021年度
- 課題への総配分額
- 174,251 千円
- 研究概要（2021）
- ブラジルにおいて薬剤耐性真菌の収集・保存事業を進め、当該国における真菌研究体制基盤の強化を行う。また、ブラジルにおける深在性真菌症の診療ハンドブックの策定に向けた作業を行う。さらにLAMP法などを用いた薬剤耐性真菌検出法の新たな開発を継続する。日本国内においても国立感染症研究所と協働し、アスペルギルス、カンジダの薬剤耐性の疫学、耐性機構の解析を行う。そのうえで、両国における薬剤耐性機構の比較を行い、国や地域の実情に適合した検出法の改良を行うとともに、次世代シークエンサー等を用いながら新たな耐性メカニズムの解明を進めてゆく。本研究で得られた貴重な真菌株については千葉大学-カンピーナス大学間の協定に基づき、積極的に相互分譲を行い、サステナブルな研究協力体制の強化を図ってゆく。
- 研究概要（2020）
- 日本・ブラジル両国における薬剤耐性真菌の疫学調査、耐性メカニズムの解明を行う。耐性パターンの国・地域特性を考慮し、遺伝子変異に因る耐性真菌の迅速検出法の開発および臨床分離株を用いた検証を行う。動物感染モデルを用いた耐性菌感染の病態解析を行う。短期専門家訪問および外国人本邦研修による研究指導を行い、技術の共有を図る。サンパウロ州内の複数の医療機関・研究機関を連携して研究ネットワーク構築を推進する。真菌株保存事業推進のため、プロジェクトで使用した真菌株を中心に、両国間で積極的に相互分譲を進める。カンピーナス大学を中心とした真菌症リファレンス体制を強化するため、症例データベースの構築及びデータ品質管理、定例カンファレンス開催の支援を行う。
- 研究概要（2019）
- ブラジルカンピーナス首都圏における薬剤耐性真菌の疫学状況を把握する。両国で収集された耐性真菌株を用い耐性機構解明・検出法の確立に向けた検証、感染モデルの検討を行う。カンピーナス大学が薬剤耐性真菌によるものを含めた深在性真菌感染症研究を中心とした研究ネットワークの中心的機関として、また貴重な菌株の保存施設として機能するための基盤構築を継続する。
- 研究概要（2018）
- 国内およびブラジルで収集された耐性真菌株を用い耐性機構解明・検出法の確立に向けた検証、感染モデルの検討を行う。相手国機関が耐性真菌を中心とした菌株保存施設として機能するための基盤構築を継続する。
- 研究概要（2017）
- 国内で収集された耐性真菌株を用い耐性機構解明・検出法の開発に向けた条件検討、感染動物モデル確立の検討を行う。また当センターが我が国における耐性真菌のリファレンスセンターとして機能するための体制づくりに着手する。
- 研究概要（2016）
- 国内の臨床分離株を用いて薬剤感受性試験、既知の耐性遺伝子の検索などを行うとともに各種遺伝子増幅法を利用し診断法開発のための予備実験を行い、国際共同研究への準備を行う。
研究成果情報
2021
2020
2019
2018
2017
2016
成果の概要
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（１）耐性菌収集と耐性遺伝子の探索
我が国の臨床分離耐性株を対象にCRISPR/Cas9システムを用いて耐性メカニズムについて詳細な検討を行った（Med Mycol 2021）。また、我が国に置ける臨床分離・環境分離Candida tropicalis株を解析したところ、臨床分離株のおよそ半数でアゾール耐性が判明した。さらにこの耐性に薬剤排出ポンプ発現亢進が関与していることを突き止め論文として報告した（Clin Micrbiol Infect 2021）。さらに我が国を含めた複数の国で分離された臨床分離・環境分離Candida krusei株を解析した結果、株は大きく2つの群に分かれ、日本株は1つのclade内に分類されることを明らかにした（Antimicrob Agents Chemother 2021）。
ブラジルで1999年に収集した環境分離耐性株の遺伝子解析を施行したところ、cyp51Aに変異を有
することが明らかとなったが、その変異はこれまで報告されたことのないものであった
（TR46/F495I）。TR46を有している耐性株は2011年にオランダで報告されたものが初めてであったが
それよりも早くブラジルで検出されていたことを明らかにすることができた。現在過去に報告された
TR46株との関連性を解析しており、論文として報告予定である。
（２）耐性真菌迅速診断法開発
ブラジルにおいてはcyp51A遺伝子のプロモーター領域に塩基の繰り返し配列（tandem repeat,
TR）を有する変異を有する耐性株が多く検出されることが明らかとなったことから、このTR型の変異
を検出するLAMP法の開発に着手し、プロモーター領域の繰り返し配列を標的にプローベの検討を行
い、TR46株の検出法を確立し論文として発表した（Sci Rep 2021）。一方、cyp51A遺伝子のORF領域
の点突然変異を検出する方法について検証を続けている。現在、いくつかの点突然変異については検
出法を確立した。現在論文準備中である。
（３）動物を用いた耐性真菌感染モデル研究
Silk wormに対する菌接種法、接種菌量について検討を行い、モデルとしての有用性を確認した（Mycoses 2021）。また、千葉大保存株を用いCRISPR/Cas9システムを用いた形質転換株を作出し、silk wormに対する感染実験を行っている。
（４）バイオリソース・リファレンス体制の確立
ブラジル国内の研究ネットワークはサンパウロ州以外の州にも拡大しており、医療機関間、研究機関間における研究交流がおこなわれている。本事業で構築されたブラジル複数医療機関参画の症例データベースには300症例以上が登録された。一部のデータは活用され、すでに論文として報告されている（J Med Mycol 2021）。また、菌株は1,500株以上を収集しており、確実な菌の単離、正確な菌種の同定、薬剤感受性測定等の作業を経てから順次保存作業が行われている。
我が国の臨床分離耐性株を対象にCRISPR/Cas9システムを用いて耐性メカニズムについて詳細な検討を行った（Med Mycol 2021）。また、我が国に置ける臨床分離・環境分離Candida tropicalis株を解析したところ、臨床分離株のおよそ半数でアゾール耐性が判明した。さらにこの耐性に薬剤排出ポンプ発現亢進が関与していることを突き止め論文として報告した（Clin Micrbiol Infect 2021）。さらに我が国を含めた複数の国で分離された臨床分離・環境分離Candida krusei株を解析した結果、株は大きく2つの群に分かれ、日本株は1つのclade内に分類されることを明らかにした（Antimicrob Agents Chemother 2021）。
ブラジルで1999年に収集した環境分離耐性株の遺伝子解析を施行したところ、cyp51Aに変異を有
することが明らかとなったが、その変異はこれまで報告されたことのないものであった
（TR46/F495I）。TR46を有している耐性株は2011年にオランダで報告されたものが初めてであったが
それよりも早くブラジルで検出されていたことを明らかにすることができた。現在過去に報告された
TR46株との関連性を解析しており、論文として報告予定である。
（２）耐性真菌迅速診断法開発
ブラジルにおいてはcyp51A遺伝子のプロモーター領域に塩基の繰り返し配列（tandem repeat,
TR）を有する変異を有する耐性株が多く検出されることが明らかとなったことから、このTR型の変異
を検出するLAMP法の開発に着手し、プロモーター領域の繰り返し配列を標的にプローベの検討を行
い、TR46株の検出法を確立し論文として発表した（Sci Rep 2021）。一方、cyp51A遺伝子のORF領域
の点突然変異を検出する方法について検証を続けている。現在、いくつかの点突然変異については検
出法を確立した。現在論文準備中である。
（３）動物を用いた耐性真菌感染モデル研究
Silk wormに対する菌接種法、接種菌量について検討を行い、モデルとしての有用性を確認した（Mycoses 2021）。また、千葉大保存株を用いCRISPR/Cas9システムを用いた形質転換株を作出し、silk wormに対する感染実験を行っている。
（４）バイオリソース・リファレンス体制の確立
ブラジル国内の研究ネットワークはサンパウロ州以外の州にも拡大しており、医療機関間、研究機関間における研究交流がおこなわれている。本事業で構築されたブラジル複数医療機関参画の症例データベースには300症例以上が登録された。一部のデータは活用され、すでに論文として報告されている（J Med Mycol 2021）。また、菌株は1,500株以上を収集しており、確実な菌の単離、正確な菌種の同定、薬剤感受性測定等の作業を経てから順次保存作業が行われている。
学会誌・雑誌等における論文一覧
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1. Martins AC, Psaltikidis EM, Lima TC, Fagnani R, Schreiber AZ, Conterno LO, Kamei K, Watanabe A, Trabasso P, Resende MR, Moretti ML: COVID-19 and invasive fungal coinfections: a case series at a Brazilian referral hospital. J Med Mycol 2021, doi: 10.1016/j.mycmed.2021.101175.
2. Trabasso P, Matsuzawa T, Arai T, Hagiwara D, Mikami Y, Moretti ML, Watanabe A: Development and validation of LAMP primer sets for rapid identification of Aspergillus fumigatus carrying the cyp51A TR46 azole resistance gene. Sci Rep 2021, doi: 10.1038/s41598-021-96651-7.
3. Toyotome T, Onishi K, Sato M, Hagiwara D, Watanabe A, Takahashi H: Identification of novel mutations contributing to azole tolerance of Aspergillus fumigatus through in vitro exposure to tebuconazole. Antimicrob Agents Chemother 2020, doi: 10.1128/AAC.02657-20.
4. Hino Y, Watanabe A, Seki R, Tsukamoto S, Takeda Y, Sakaida E, Kamei K: A Reference Laboratory Surveillance on Fungal Isolates from Patients with Haematological Malignancy in Japan. J Fungi 2021, doi: org/10.3390/jof7100806.
5. Arai T, Umeyama, T, Majima H, Inukai T, Watanabe A, Miyazaki Y, Kamei K: Hmg1 mutations in Aspergillus fumigatus and their contribution to triazole susceptibility. Med Mycol 2021, doi: 10.1093/mmy/myab026.
6. Majima H, Arai T, Kusuya Y, Takahashi H, Watanabe A, Miyazaki Y, Kamei K: Genetic differences between Japan and other countries in cyp51A polymorphisms of Aspergillus fumigatus. Mycoses 2021, doi: 10.1111/myc.13370.
7. Khalifa HO, Watanabe A, Kamei K: Azole and Echinocandin Resistance Mechanisms and Genotyping of Candida tropicalis in Japan: Cross-Boundary Dissemination and Animal-Human Transmission of C. tropicalis Infection. Clin Microbiol Infect 2021, doi.org/10.1016/j.cmi.2021.10.004.
8. Takahashi H, Umemura M, Ninomiya A, Kusuya Y, Shimizu M, Urayama S, Watanabe A, Kamei K, Yaguchi T, Hagiwara D: Interspecies Genomic Variation and Transcriptional Activeness of Secondary Metabolism-Related Genes in Aspergillus Section Fumigati. Front Fungal Biol, April 2021, Volume 2, Article 656751. doi: org/10.3389/ffunb.2021.656751.
9. Khalifa HO, Hubka V, Watanabe A, Nagi M, Miyazaki Y, Yaguchi T, Kamei K: Prevalence of Antifungal Resistance, Genetic Basis of Acquired Azole and Echinocandin Resistance, and Genotyping of Candid krusei recovered from an International Collection. Antimicrob Agents Chemother 66(2): e0185621, 2022, doi: 10.1128/AAC.01856-21.
10. Takeda K, Suzuki J, Watanabe A, Narumoto O, Kawashima M, Sasaki Y, Nagai H, kamei K, Matsui H: Non-fumigatus Aspergillus infection associated with a negative Aspergillus precipitin test in patients with chronic pulmonary aspergillosis. J Clin Microbiol 60(2): e0201821, 2022, doi: 10.1128/JCM.02018-21.
学会・シンポジウム等における口頭・ポスター
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1. 薬剤耐性真菌、渡辺哲，新居鉄平，亀井克彦、第95回日本感染症学会総会・学術講演会第69回日本化学療法学会総会、横浜、2021.5.7-9、国内、口頭
国内 / 口頭
2. 5SNPs+M2201変異Cyp51Aを有するAspergillus fumigatusのazole薬感受性に関する検証、馬嶋秀考，新居鉄平，渡辺哲，亀井克彦、第95回日本感染症学会総会・学術講演会第69回日本化学療法学会総会、横浜、2021.5.7-9、国内、口頭
国内 / 口頭
3. Fungal co-infection in COVID-19 patients、渡邉哲、第95回日本感染症学会総会・学術講演会第69回日本化学療法学会総会、横浜、2021.5.7-9、国内、口頭
国内 / 口頭
4. Antifungal Synergism Against Echinocaridin Resistant and Susceptible Candida glabrata、Hazim Khalifa、馬嶋秀考、渡邉哲、亀井克彦、第95回日本感染症学会総会・学術講演会第69回日本化学療法学会総会、横浜、2021.5.7-9、国内、口頭
国内 / 口頭
5. シンポジウム あらためて、培養検査の重要性、渡辺哲，亀井克彦、第65回日本医真菌学会総会・学術集会、東京、2021.10.29-30、国内、口頭
国内 / 口頭
6. ICD講習会 真菌症のトピックス～薬剤性真菌と新興真菌、渡邉哲、第65回日本医真菌学会総会・学術集会、東京，2021.10.30、国内、口頭
国内 / 口頭
7. 教育セミナー カンジダ症、渡邉哲、第65回日本医真菌学会総会・学術集会、東京，2021.10.29-30、国内、口頭
国内 / 口頭
8. Aspergillus fumigatus が有するHMG-CoA還元酵素アイソザイムは生存に必要なのか？、新居鉄平、渡邉哲、亀井克彦、第65回日本医真菌学会総会・学術集会、東京，2021.10.30、国内、ポスター
国内 / ポスター
9. Aspergillus fumigatus 感性株は本邦と欧州で異なったcyp51A遺伝子多型をもつ、馬嶋秀考，新居鉄平，楠屋陽子，高橋弘喜，渡邉哲，矢口貴志，宮崎泰成，亀井克彦、第65回日本医真菌学会総会・学術集会、東京，2021.10.30、国内、ポスター
国内 / ポスター
10. シンポジウム 薬剤耐性真菌 薬剤耐性真菌検出法の開発、渡邉哲、第70回日本感染症学会総会東日本地方会学術集会・第68回日本化学療法学会東日本支部総会 合同学会、Web/東京、2021.10.27-29、国内、口頭
国内 / 口頭