During this funding period, we focused on purifying BoNT/X from the previously constructed plasmid-cured C. botulinum strain 111, which was shown to express only BoNT/X in the previous funding period.
● A series of precipitation and chromatography steps were evaluated for the purification method, based on previous purification schemes for other BoNT serotypes. The final successful sequence of steps involved 60% ammonium sulfate precipitation of 4 day culture supernatant, followed by extraction in phosphate buffer and gel filtration chromatography, then cation exchange chromatography, and finally anion exchange chromatography. This resulted in sufficient semi-purified BoNT/X for initial toxicity assessment, although further effort is require to improve purity of BoNT/X.
● An in vitro assay showed strong VAMP2 cleavage activity by BoNT/X.
● Initial toxicity studies indicated that local intramuscular injection of 750 ng of this semi-purified BoNT/X resulted in local paralysis in mice, whereas intraperitoneal injection of 1 μg into mice resulted only in mild and temporary symptoms consistent with botulism but no deaths.
Altogether, the we purified BoNT/X complex from plasmid cured C. botulinum strain 111, showed that the toxin is produced as a 150 kDa that is reduced to 100 kDa and 50 kDa domains by DTT treatment indicating proper dichain formation, demonstrated catalytic activity, and finally determined paralytic activity in mice at 750 ng.
In the next study period, we will further optimize purification of BoNT/X from plasmid cured C. botulinum strain 111 and use highly purified BoNT/X for toxicity studies.

本研究期間においては、前期間で作製したplasmidを脱落させた111株（BoNT/Xのみ産生）を用いて培養上清からのBoNT/Xの精製を試みた。
● 他の血清型BoNTの精製方法を基にBoNT/Xの精製プロトコールを構築した。4日間嫌気培養した培養上清を回収し、60%硫安沈殿を行った。その後、ゲル濾過カラム、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラムを用いて精製し、粗精製BoNT/Xを得ることができた。
● 組換えタンパク質として発現させた基質（VAMP2）を用いたin vitroでのアッセイの結果、BoNT/Xは強い基質切断活性を示した。
● 粗精製BoNT/X 750 ngをマウス後し筋に投与した結果、局所的な麻痺が確認された。一方で、粗精製BoNT/X 1.0 μgを腹腔内投与したマウスはわずかにボツリヌス症様の症状を示したが、その症状は一時的であり、生存し続けた。

今回、plasmidを保持しない111株を用いてBoNT/Xを精製した。BoNT/X（分子量150 kDa）は還元剤（DTT）存在下では、100 kDaと50 kDaのドメインに還元されるため、ジスルフィド結合による2本鎖構造をもつことが示された。また基質VAMP2を切断する活性や、マウスにおける局所的な活性も確認できた。今後は、精製方法を最適化し、高純度のBoNT/Xを得る必要がある。そのBoNT/Xを用いて毒素活性を詳細に解析したい。