食中毒・呼吸器疾患関連ウイルスの高感度かつ迅速検出技術の開発
研究課題情報
- 課題管理番号
- 21hm0102080h0002
- 統合プロジェクト(二期)
医療機器・ヘルスケアプロジェクト<第二期>
- 事業名
医療分野研究成果展開事業
- タグ(2021)
研究の性格: 新規診断法・検査法・検査体制の開発、確立、検証<診断薬・診断機器開発は除く>
開発フェーズ: 基礎的
承認上の分類: 医療機器
対象疾患: その他
疾患領域: 感染症
開発目的: 診断
- タグ(2020)
研究の性格: 医薬品・医療機器等の開発を目指す研究<医療機器開発につながるシステム開発を含む>
開発フェーズ: 基礎的
承認上の分類: 医療機器
対象疾患: その他
疾患領域: 感染症
開発目的: 診断
- 代表研究機関
- 国立大学法人静岡大学
- 研究代表者
(2021) 朴龍洙, 国立大学法人静岡大学, グリーン科学技術研究所 グリーンケミストリー研究部門 教授
(2020) 朴龍洙, 国立大学法人静岡大学, グリーン科学技術研究所 グリーンケミストリー研究部門 教授
- 研究期間
- 2020年度 - 2021年度
- 課題への総配分額
- 50,800 千円
- 研究概要(2021)
- 本研究で開発予定であったポリアニリン電極は、感度は高いもののデタージェントを含む検体に対して耐久性が弱いことが明らかになった。従って、当初計画したポリアニリン電極の安定性の向上と平行してデタージェントを含む検体用のディスポーザブル(ディスポ)電極を開発する必要がある。また、遺伝子検査に応用可能なディスポ電極の開発を行い、電気化学的手法でウイルスのRNA検出を行う。ウイルス検出用ディスポ電極が市販の小型インピーダンス測定装置に対応可能かどうかを既存のインピーダンス測定装置と比較して行い、小型インピーダンス測定装置の開発に必要なデータを確保できるシステムの構築を進める。
- 研究概要(2020)
- 本研究では、ウイルスの存在を電気シグナルとして捉える独創的な電極センサーを用いて、食中毒また呼吸器疾患関連として公衆衛生上重要と考えられるウイルス(粒子または遺伝子)の高感度かつ迅速検出技術の開発を特徴とする。この目的を達成するために、審査委員の提言を取り入れ、初年度からディスポーザブル電極の開発を開始する。本研究で目指す電極の技術的可能性を検討し、様々な環境に耐えるナノ材料の確認を経て、電極の設計、試作を行う。また、試作するディスポーザブル電極を評価するために標的ウイルス材料や抗体類を確保する。
研究成果情報
2021
2020
成果の概要
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(ディスポ電極の作製・試作及び検出機器の開発)金電極の表面にポリアニリン(PAni)、金ナノ粒子-ポリアニリン複合体(Au-PAni)、抗体-N,Sグラフェン量子ドット複合体(Ab-NS-GQD)の3層ナノ構造電極を作製し、ウイルス検出を行った結果、検出感度1~10 pg/mLレベルで、変動係数(CV値)が20~40%であった。そこで、PAniとNS-GQD の合成を最適化した後、インフルエンザウイルスやノロウイルス様粒子の検出を行ったところ、検出感度100 fg/mL(CV値=14~28%)まで向上した。一方、Au-PAni層にストレプトアビジンービオチン化抗体を修飾した電極では同様な検出感度でCV値は20%以下まで改善した。実装できるディスポ電極の作製を目的に、導電性カーボンインクを電極部に、ポリイミドを披印刷体にした電解重合工程を検討し電極部に腐食を生じないスクリーン印刷条件を確立した。ポリアニリン層のみを堆積した電極では、変動係数6%と許容範囲であった。また、電子回路を電子基板上に構築し、電極を模した条件下で既存の検出機器と同等のデータを得たので、今後電子基板を再設計して携帯可能なサイズの検出機器を完成する。
(ウイルス抗原の調製・解析)ノロウイルスGII-4由来のウイルス様粒子及び培養細胞系で増殖させた季節性インフルエンザウイルスH3N2抗原を調製した。エンベロープウイルス粒子をone-step粒子精製法の基本技術を構築した。細胞培養を用いてA型、E型肝炎ウイルス(HAV、HEV)の構造蛋白を発現し、ウイルス様粒子を作製・精製を行い抗体を作製した。
(臨床検体の収集・遺伝子解析)臨床検体を含むコロナウイルスのRNA量を定量測定するreal-time RT-PCRを構築し、陰性・陽性臨床サンプルを収集した。iSeq100、および、その周辺機器の整備を行い、新型コロナウイルスの遺伝子解析を通常の8倍早く、費用面では1/4程度で解析できる体制を構築した。56症例分の前兆ゲノム解析を元に、近縁系統の解析を行ったところ、R.1は6株、アルファ株は40株、デルタ株は10株であった。また、アルファ株とデルタ株は、それぞれ2020年4月頃と2020年1月頃Wuhan-1株から分岐したことが明らかになった。
(ウイルス抗原の調製・解析)ノロウイルスGII-4由来のウイルス様粒子及び培養細胞系で増殖させた季節性インフルエンザウイルスH3N2抗原を調製した。エンベロープウイルス粒子をone-step粒子精製法の基本技術を構築した。細胞培養を用いてA型、E型肝炎ウイルス(HAV、HEV)の構造蛋白を発現し、ウイルス様粒子を作製・精製を行い抗体を作製した。
(臨床検体の収集・遺伝子解析)臨床検体を含むコロナウイルスのRNA量を定量測定するreal-time RT-PCRを構築し、陰性・陽性臨床サンプルを収集した。iSeq100、および、その周辺機器の整備を行い、新型コロナウイルスの遺伝子解析を通常の8倍早く、費用面では1/4程度で解析できる体制を構築した。56症例分の前兆ゲノム解析を元に、近縁系統の解析を行ったところ、R.1は6株、アルファ株は40株、デルタ株は10株であった。また、アルファ株とデルタ株は、それぞれ2020年4月頃と2020年1月頃Wuhan-1株から分岐したことが明らかになった。
学会誌・雑誌等における論文一覧
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1. Ojodomo J. Achadu, Njemuwa Nwaji, Dongkyu Lee, Jaebeom Lee, Eser M. Akinoglu, Michael Giersig, Enoch Y. Park, 3D hierarchically porous magnetic molybdenum trioxide@gold nanospheres as a nanogap-enhanced Raman scattering biosensor for SARS-CoV-2, Nanoscale Advances. 2022; 4: 871-883, DOI: 10.1039/D1NA00746G.
2. Wenjing Zhang, Yasushi Ami, Yuriko Suzaki, Michiyo Kataoka, Naokazu Takeda, Masamichi Muramatsu and Tiancheng Li. A Cross-Species Transmission of a Camel-Derived Genotype 8 Hepatitis E Virus to Rabbits. Pathogens. 2021, 10 (11), 1374, DOI: 10.3390/pathogens10111374.
3. Bai H, Kataoka M, Ami Y, Suzaki Y, Takeda N, Muramatsu M, Li TC. Immunogenicity and Antigenicity of Rabbit Hepatitis E Virus-Like Particles Produced by Recombinant Baculoviruses. Viruses. 2021 Aug 9; 13 (8):1573, Doi:10.3390/v13081573.
4. Chu PY, Huang HW, Boonchan M, Tyan YC, Louis KL, Lee KM, Motomura K, Ke LY. Mass Spectrometry-Based System for Identifying and Typing Norovirus Major Capsid Protein VP1. Viruses. 2021;13:2332, doi.org/10.3390/v13112332.
5. Hiroi S, Kubota-Koketsu R, Sasaki T, Morikawa S, Motomura K, Nakayama EE, Okuno Y, Shioda T. Infectivity assay for detection of SARS-CoV-2 in samples from patients with COVID-19. J Med Virol. 2021;93:5917-5923, doi: 10.1002/jmv.27145.
6. Morikawa S, Otsuka M, Yumisashi T, Motomura K. A longitudinal study on respiratory viral infection for healthy volunteers. Health Sci Rep. 2021;4:e413, doi: 10.1002/hsr2.413.
7. Tacharoenmuang R, Guntapong R, Upachai S, Singchai P, Fukuda S, Ide T, Hatazawa R, Sutthiwarakom K, Kongjorn S, Onvimala N, Luechakham T, Ruchusatsawast K, Kawamura Y, Sriwanthana B, Motomura K, Tatsumi M, Takeda N, Yoshikawa T, Murata T, Uppapong B, Taniguchi K, Komoto S. Full genome-based characterization of G4P[6] rotavirus strains from diarrheic patients in Thailand: Evidence for independent porcine-to-human interspecies transmission events. Virus Genes. 2021;57:338-357, DOI: 10.1007/s11262-021-01851-y.
8. Kurata T, Kanbayashi D, Komano J, Motomura K. Relationship between biochemical markers and measles viral load in patients with immunologically naive cases and secondary vaccine failure: LDH is one of the potential auxiliary indicators for secondary vaccine failure. Microbiol Immunol. 2021;65:265-272, DOI: 10.1111/1348-0421.12891
9. Ikemori R, Aoyama I, Sasaki T, Takabayashi H, Morisada K, Kinoshita M, Ikuta K, Yumisashi T, Motomura K. Two Different Strains of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus (SFTSV) in North and South Osaka by Phylogenetic Analysis of Evolutionary Lineage: Evidence for Independent SFTSV Transmission. Viruses. 2021;13:177, doi: 10.3390/v13020177.
10. Kurata T, Yamamoto SP, Nishimura K, Yumisashi T, Motomura K, Kinoshita M. A measles outbreak in Kansai International Airport, Japan, 2016: Analysis of the quantitative difference and infectivity of measles virus between patients who are immunologically naive versus those with secondary vaccine failure, Journal of Medical Virology. 2021; 93:3446-3454, doi: 10.1002/jmv.26733.
学会・シンポジウム等における口頭・ポスター
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1. 大阪府における感染症発生動向についてー2020―、本村和嗣、大阪小児医会、2021/3/13、国内、口頭。
国内 / 口頭
2. Simultaneous optical and electrochemical assay for norovirus detection using Liposome based signal amplification technique、Akhilesh B. Ganganboina, Ankan D. Chowdhury, and Enoch Y. Park、Biosensors 2021, 2021/07/27,国外、口頭。
国外 / 口頭
3. Utilization of chromogen-embedded nanovesicle and its catalytic oxidation in colorimetric detection of virusIndra、Indra M. Khoris, Akhilesh B. Gangganboina, Ankan D. Chowdhury, and Enoch Y. Park、Biosensors 2021, 2021/07/28,国外、口頭。
国外 / 口頭
4. 量子ドットを包埋したハイブリットナノアーキテクチャーの作製と抗HEV抗体の検出への応用、Akhilesh Babu Ganganboina、竹村謙信、Wenjing Zhang、李 天成、朴 龍洙、第73回(2021年)日本生物工学会大会、2021/10/27、国内、口頭。
国内 / 口頭
5. 磁気ナノ粒子による金ポリアニリンベース電気化学的ウイルスセンサーの感度向上、敦賀健太, アンカンダッタチョードリー、朴 龍洙、第73回(2021年)日本生物工学会大会、2021/10/27、国内、口頭。
国内 / 口頭
6. Development of binary responsive virus biosensor using chromogen-encapsulated polymeric nanocarrier、Indra M. Khoris, Akhilesh B. Ganganboina, Enoch Y. Park、第73回(2021年)日本生物工学会大会、2021/10/27、国内、口頭。
国内 / 口頭
7. Duplex-Specific Nucleaseを利用した 蛍光検出によるSARS-CoV-2検出技術の開発、砂金敬太, Ankan Dutta Chowdhury, 朴 龍洙、第11回シーズ&ニーズビジネスマッチング研究発表会、2022/01/13、国内、口頭。
国内 / 口頭
8. pH応答性ナノゲルを用いたノロウイルスバイオセンサーの開発、前畑秀叡、Achadu Ojodomo、朴 龍洙、第11回シーズ&ニーズビジネスマッチング研究発表会、2022/01/13、国内、口頭。
国内 / 口頭
9. Decoration of GII.4 Norovirus-like Particles via SpyTag/SpyCatcher Bioconjugation System for a Modular Protein-displaying Platform, Jirayu Boonyakida, Fahmida Nasrin, Indra Memdi Khoris, and Enoch Y. Park, The 1th SU-CNU Joint Symposium, 2022/01/21, 国外, 口頭。
国外 / 口頭
10. Development of Fluorescence Amplified SARS-CoV-2 detec-tion using Duplex-Specific Nuclease, Keita Isago, Ankan Dutta Chowdhury, and Enoch Y. Park, The 1th SU-CNU Joint Symposium, 2022/01/21, 国外, 口頭。
国外 / 口頭