HBVのpreS1領域に対するモノクローナル抗体を樹立し、in houseの抗原測定系を作製し、HBV持続感染患者の病態とpreS1蛋白の動態を解析し、これまでのマーカーになかった特徴を明らかにした。さらにこのモノクローナル抗体を利用した高感度のpreS1抗原、抗体の測定系を構築した。preS1の測定系はB型慢性肝炎患者の肝細胞癌発症の予測に有用であることを示した。また、宿主側のHBVレセプターであるNTCPに対するモノクローナル抗体を樹立し、この抗体が胆汁酸代謝を強く阻害することなくウイルスの感染を防御することを示し、治療への応用が可能である可能性を示した。また、HBVのcccDNAの高感度の正確な測定系を確立した。
宿主因子のKIF4がNTCPの肝細胞表面への表出に重要であり、RXR agonistがこの働きを阻害し、抗ウイルス治療として成立する可能性を示した。また、同様に宿主因子のTRAIL-R3がHBV感染により肝細胞内で増加し、肝細胞のアポトーシスを抑制することによりウイルス増殖を助長している可能性を示した。
HBVが持続感染したヒト肝細胞キメラマウスを使用して、αIFN投与時のウイルスの動態を明らかにし、抗ウイルス効果のあり方を明らかにした。
HBVのコアプロモーターからのウイルスRNAの転写に対して宿主因子のMafFが抑制的に作用し、ウイルス増殖を妨げることを明らかにした。
HBVの各種genotypeの感染性ウイルス粒子を細胞とクローンを使用して作製し、その増殖の特徴を明らかにするとともにIFNに対する反応性の差異も明らかにした。
NIHのJake Liang 博士との共同研究によりHBVの宿主レセプターであるNTCPの遺伝子多型であるNTCP-S267FによってHBVの感染性が低下することをゲノム編集の手法を用いてin vitroで明らかにした。 (茶山一彰)
HBV cccDNA標的スクリーニング系を用いて２万７千種類の化合物を評価し、複数の候補化合物を発見した。これは、前回の約４千種類の化合物スクリーニングで得られた化合物とは全く違う構造であった。(加藤)
今年度は、HBVの持続感染モデルに適していると考えられるcDNA-uPA/IL2RgcKO/Rag2KOマウス、およびGVHDが回避できると考えられるcDNA-uPA/IL2RgcKO/Rag2KO/MHC1KO/MHC2KOマウスにヒト肝細胞とヒト免疫細胞を移植し、これらの細胞をマウス体内で長期間維持できるDualキメラマウスの作製、およびHBV持続感染に成功した。(立野)
前年度までに確立したゲノム編集解析システム「MaChIAto」を用いて解析可能なPrime Editing技術について、肝炎研究に応用するための基礎検討を実施し、細胞集団において90%の編集効率、およびクローン化細胞において50%以上の全アレル改変を達成した。(山本)
We aimed to identify pro-HBV host factors and use it to develop new anti-HBV therapeutic. Using this grant, we previously identified KIF4 as pro-HBV host factor that is required for HBV infection. We also reported that it regulates HBV entry by inducing the expression of NTCP on cell surface. We found that KIF4 acts as a transporter for NTCP from the cytoplasm to cell surface, and that knocking down KIF4 expression or inactivating its ATPase motor domain significantly reduced surface expression of NTCP, and inhibited HBV and HDV infection. In 2021, we analyzed targeting of KIF4 expression as a possible anti-HBV/HDV entry inhibitor. We found that RXR agonists, especially Bexarotene significantly suppressed KIF4 expression and in turn HBV/HDV entry (IC50 1.8 uM). The manuscript of this work was drafted, submitted and accepted (March 2022, PLoS Pathog 18(3): e1009983. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009983). （Aly）
安定化HBVポリメラーゼを精製して構造解析を行うために、Expi293細胞での発現のためのベクターを構築した。また、センダイウイルスを用いてHBVプレゲノムRNAを細胞で発現させて、HBVの複製を起こすシステムを開発した。(坂口）
今年度は、HBV持続感染を阻害するような因子をin vitro, 長期HBV感染モデルを用いたin vivoの系で作用させ、cccDNAの量的変化を解析した。これまでの結果をまとめ、論文執筆中である。(茶山弘美)
核移行シグナルを最適化することでゲノム編集効率に優れたCas12a改変体の作製に成功した。さらに本Cas12a改変体を発現する改良型アデノウイルスベクター（肝毒性を軽減可能）を作製し、その優れたゲノム編集効果を実証した。(水口)
他の研究班や理化学研究所とも連携して、HBV感染に関わる宿主因子、HBV感染のレセプターであるNTCPに対するモノクロ―ナル抗体を作製した。ヒト肝細胞キメラマウスでは、患者血清投与に先立って投与することで、感染の成立を抑制した。その一方で、血中胆汁酸の上昇は一過性であった。(三木)
これまでにHBV増殖にNEDD8化が関与することを見出し、NEDD8化阻害剤がHBV増殖を抑制できることを見出してきたが、さらにNEDD8化阻害薬を探索し、新規のHBV増殖を抑制できる化合物を同定した。また、HBV増殖特異的にNEDD8化される蛋白質を探索し、HBVコア蛋白質のリジン残基のNEDD8化がコア蛋白質の安定化に寄与し、粒子形成を促進することを見出した。(岡本)
HBV proteins interact with numerous host proteins, many of which remain likely to be identified. As HBV only encodes a small number of proteins that must interact with a large number of host proteins, we hypothesized that these proteins share common structural motifs that could be predicted using machine learning, revealing novel drug targets and mechanisms involved in the HBV life cycle. We created a protein feature matrix and trained an AutoKeras model to predict HBV-interacting proteins. The model achieved an f1 score of 0.86 and identified most known HBV-interacting proteins as well as predicted several potential novel HBV-interacting proteins.（Nelson）
血清由来のB型肝炎ウイルス（sHBV）は、NTCPで再構成したHepG2細胞への感染性が低いことがこれまでに報告されているが、そのメカニズムはよくわかっていない。本研究ではHepG2/NTCP細胞への感染性が低いsHBVには、Core遺伝子の一部を欠失したHBVが含まれていることが判明した。(藤野)