多剤耐性腸球菌（VRE）は院内感染の原因菌として知られ、心内膜炎や敗血症などの日和見感染を引き起こし、深刻な問題になっている。我々は、VREの生存にV-ATPaseと呼ばれるATP駆動のナトリウムポンプが重要な役割を担っていることを明らかにし、V-ATPaseの活性を阻害する化合物Aを同定した。本研究では、VREのV-ATPaseを分子標的とした新規抗菌薬の開発を目標としている。本年度は以下の研究を行った。
<1> VREに対する抗菌作用の検証---昨年度の研究で創出した化合物Aの誘導体および異なる骨格を持つ新規化合物について、精製したV-ATPaseのATP分解阻害活性を調べ、阻害剤としての効果を明らかにした。阻害活性が高かった化合物に対して、各種VREに対する生育阻害範囲を決定した。
<2> マウスへの阻害剤の効果の検証---各種マウスモデルを検証し、カプセル投与可能でありアウトブレッドで使用数が一番多いクローズドコロニーのICRマウスを使用することに決定した。8匹を4匹ずつ2群に分け、セフォペラゾンを自由飲水で投与した。抗生物質投与の7日後に、VREを経口ゾンデで投与し感染させた。VRE感染から3日目に解剖して腸管内容物を採取し、選択培地を用いたCFU assayから生菌数の解析を行った。続いて、16S rRNA配列に基づくq-PCRを用いたメタ16S解析を行い、腸管内容物に含まれるVREの割合と阻害剤による影響を評価した。上記検証実験の結果、小腸内容物から検出されたVREの生菌数は化合物Bの投与により10^-2に減少していた。また、q-PCRの結果からも化合物Bの投与により小腸でのVREの定着を100倍程度抑制していることが示唆された。以上の結果から、化合物Bはマウス小腸において、VREの定着を顕著に抑制でいることが示唆された（論文準備中）。
<3> VERに対する新規抗菌剤の創出---昨年度までの研究により、V-ATPase全複合体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析により立体構造を得ることに成功した。本年度は得られた立体構造情報に基づきMOE（統合計算化学システム）を用いて結合親和性が向上すると予想される誘導体を設計し、新たに12種類について有機合成に成功した。その中でマウス実験には溶解性の高い化合物Bを使用した。