ヒトiPS細胞からLeydig細胞への分化誘導法の確立するため、複数の方法の開発を並行して進めた。本年度は、遺伝子導入に因らない方法の探索と、遺伝子導入による方法で種々の条件の最適化の検討に注力した。その結果、後者の中で極めて良好な分化が安定して得られる得られる方法が見いだされた。作製したiPS細胞由来Leydig細胞はin vitroで長期にテストステロンを分泌しながら増幅し、凍結融解も可能であった。免疫隔離カプセルとなるアルギン酸に封入してもin vitroでテストステロン分泌を続けることも確認された。我々が開発した分化誘導法はセル・ソーターなどによる純化プロセスを経なくてもLeydig細胞マーカー陽性細胞の純度は９９％を超えており、一方、未分化細胞残存の指標としたLIN28AのmRNA量は、ヒト線維芽細胞にヒト未分化iPS細胞0.002%をスパイクした検体よりも小さかった。さらに、single cell RNAseqのデータからヒトLeydig細胞と作製したヒトiPS細胞由来Leydig細胞のmolecular signatureを比較したところ、両者は極めて類似したパターンを示した。今後、in vivoに移植する系についての検討が必要であると考えられた。