本研究提案における令和３年度の研究計画は①Staple核酸の動物個体内における機能評価、②Staple核酸のオフ・ターゲット効果に関する検討評価、③Staple核酸を人工核酸化する検討、の3点を予定していた。以下、それぞれについて報告する。
① Staple核酸の動物個体内における機能評価
令和2年度までにおいてマウス心筋細胞のTRPC6発現を抑制していることを証明することに成功していた。そこで肺動脈性高血圧症を模倣するTAC処理を施したマウスを利用して、Staple核酸投与によるフェノタイプ評価を行った。その結果顕著に心筋肥大の抑制効果を確認することに成功し、標的細胞に導入されれば動物個体内でもStaple核酸の効果を発揮することが可能であることの証明に成功した。
②　Staple核酸のオフ・ターゲット効果に関する検討評価
　検討項目①において標的タンパク質の発現抑制に成功した臓器細胞をプロテオーム解析し、標的外遺伝子発現の変動を網羅的に評価した。その結果、実験間誤差と考えられる遺伝子発現の変動がいくつかで確認されたものの、顕著なオフターゲット効果は認められなかった。また、血液検査による肝毒性・腎毒性評価においても想定外の遺伝子発現変動は確認されなかった。これは、Staple核酸の高い標的選択性に由来した結果だと期待できるものであった。
③　Staple核酸を人工核酸化する検討
　本検討においてはMorpholino、2’MOE、他2種類の人工核酸をStaple核酸として利用し検討をおこなった。申請書に記載した計画よりも少ない種類の評価にとどまったが、後述する通り、4種類とも良好な結果が得られた。これ以上種類を増やすよりも、現状良好な結果が得られているこの4種類の人工核酸の知見を深めることが医薬品化への最短ルートであると判断した。
Morpholino、2’MOEは既に上市された核酸医薬に使われているものであることから、ある程度の安全性の高さは担保されているものして利用した。また他2種類の人工核酸は標的mRNAに対して、強い結合脳を示すことが知られており、導入するStpale核酸の短鎖化が期待できる。このような理由で4種類選定したが、いずれの人工核酸もRNA G-quadruplexの形成を誘導し、逆転写酵素の伸長抑制を持つことが明らかになった。その中でも知的財産権の観点から記載することができないが、ある人工核酸に特化して検討をおこなった結果、AteloGeneと呼ばれる動物体内でも作用するリポフェクタミンを利用しても心臓におけるTRPC6の発現抑制を確認することに成功した。