COVID-19の原因となるSARS-CoV-2に対する治療薬の開発は、現在、天然ウイルスをサルの腎臓細胞 (Vero細胞)に感染させて実施されている。天然ウイルスの実験にはBSL3施設で実施されるため研究施設が限られている。本研究グループはより多くの研究者が参加しやすい研究環境を整備するためSARS-CoV-2レプリコンを開発した。レプリコンではウイルス粒子の構造タンパク質の遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に置換しているので、感染性がなくBSL2施設での実験が可能である。さらに、臨床での薬剤の効果を正確に予測するためにはヒトの細胞での評価が重要であると考え、ヒト肝癌細胞株であるHuH-7細胞でレプリコンを複製させることに成功した。transientレプリコン発現ベクター(DNA)を細胞内に導入後、CMVプロモーターにより転写されたレプリコンが自律増殖することを確認した。本研究では、レプリコンをRNAとして細胞内に導入するstableアッセイ系の開発を目的とした。CMVプロモーターをT7プロモーターに置換したレプリコンベクターを作成した。T7プロモーターによりin vitroで転写したレプリコンには薬剤 (G418)耐性遺伝子を組み込んであるため、レプリコンを導入した細胞を、G418を添加した状態で培養した時にレプリコンが自律増殖するとコロニーが形成される。現在、出現したコロニーのクローニングを実施している。
並行して実施したtransientレプリコンのゲノムとサブゲノムの次世代シークエンサー (NGS)による解析を実施した。レプリコンを導入した細胞からトータルRNAを回収し、長鎖シークエンスが可能なナノポアシーケンサーによる解析を実施した。レプリコンはポリA付与されるため、ポリAによる逆転写を行いサンプル調製を行った。シークエンスを実施したところ、8G bases、6M readsが品質確認されたものとして取得できた。これらについて、レプリコンのリファレンス配列に一致する配列を取得しアライメントしたところ、レプリコン由来の配列を確認した。薬剤耐性変異の同定に向けた応用が可能な研究体制を確立することができた。
また、transientレプリコンによるSARS-CoV-2治療剤候補のスクリーニングの過程でレプリコンの増殖を抑制する食品成分を発見した。