全体概要
本研究開発では、難治性神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症（ALS）及び前頭側頭型認知症（FTD）の病態発症に関与しているとされる毒性ポリペプチドの作用機序を明らかにすることを目指している。2020年度は、2018・2019年度に続き、論文化を目指し、更なる詳細な検討を進めた。細胞膜に局在する細胞骨格制御に関わる因子に着目したところ、毒性ポリペプチドによって細胞間接着に係わる接着斑の構成因子であるERMとPAXILLINのリン酸化の増強を認めた。接着斑の構成因子は、細胞骨格のアクチンフィラメントと連動しており、細胞が硬くなったことと連動して、細胞間接着に影響を及ぼしている可能性が示唆された。また、ALS関連変異体を含むFUSフラグメントとKapβ2の結合定数を等温滴定カロリメトリー法（ITC）により解析したところ、Kapβ2は核移行シグナル（PY-NLS）以外とも相互作用することが示された。また、サイズ排除クロマトグラフィと多角度光散乱検出（SEC-MALS）の解析結果から、毒性ポリペプチドとKapβ2が1:1で結合していることが明らかになった。NMR法による解析をさらに進めることで、毒性ポリペプチドがKapβ2の核移行シグナル（NLS）結合部位（陰性荷電しているcavity部分）に結合し、その結合部位がFUSのNLS結合部位と部分的に重複し、FUSのNLS以外の領域とは重複していないことが示された。また、核移行シグナルを模した合成ペプチドであるM9Mと毒性ポリペプチドがKapβ2の相分離抑制作用を示すことを、光学顕微鏡と濁度法により確認した。また、高速AFM（HS-AFM）によるFUSの動的解析を行い、基準となる構造を持つ領域を認識することに成功した。さらに、これまでの2年間で得られたNMR解析などの知見を基に、分子動力学（MD）計算により、毒性ポリペプチドと標的タンパクとの相互作用の解析を行った。その結果、生化学的・構造生物学的な解析結果によって得られた知見を追試することに成功した。さらに、アフィニティーカラムを用いた拮抗実験から、毒性ポリペプチドはKapβ2のNLS結合部位と部分的に競合することが明らかとなった。現在、これらの成果をまとめ、Nature Communicationsに投稿中であり、6ヶ月にわたるリバイズ検討をすべて終え、リバイズ投稿を完了済である。

担当別　研究開発概要
（１）研究開発代表者：森　英一朗（奈良県立医科大学・医学部・准教授）
分担研究開発課題名：毒性ポリペプチドの生化学的・生物学的解析
研究開発成果：2018年度は、毒性ポリペプチドの配列特性についてスクランブル配列との比較を行ったところ、毒性ポリジペプチドの生化学的な性質は、プロリン・アルギニンによる繰返し配列によるものではなく、アルギニン残基の量や分布に依存している結果を得た。2019年度は、毒性ポリペプチドの繰返し回数が20回よりも少ない場合は、毒性が認められない知見を元に、繰返し回数が少ないPRペプチドが拮抗ペプチドとして機能するかを、細胞毒性や生化学的結合能の評価を行った。繰返し配列が短いPRペプチドが、細胞毒性評価では拮抗ペプチドとしての機能を有している知見は得られなかった。また、生化学的評価（オンカラム結合実験）から、Kapβ2がPR18に対しては結合するのに対して、PR8には結合しないことが明らかになった。さらに、ゲルろ過法によって結合状態が1:1の分子の比率であることを示唆する結果も得た。他には、細胞骨格であるアクチンフィラメントの動態が阻害されていることから解析を進めていく中で、オートファジー異常を示唆する知見を得た。中でも、特に細胞接着に関連した細胞骨格の動態が、毒性ポリペプチドの影響を受けることが、細胞免疫染色などの手法によって明らかになった。2020年度は、毒性ポリペプチドによって、細胞骨格の3つの構成因子であるアクチン・チュブリン（微小管）・中間径フィラメントの形態変化を免疫染色的に評価した。毒性ポリペプチドの存在下では、アクチンフィラメントの線維束が太くなり、微小管の断片化が見られた。また、中間径フィラメント・Vimentinの細胞内局在に変化を認めた。細胞骨格の柔軟性の評価を進展刺激によるアクチンフィラメントの配向性変化で評価すると、毒性ポリペプチドによってアクチンフィラメントの配向変化が阻害された。また、分子間力顕微鏡（AFM）による評価では、細胞が硬くなっていることが示された。

（２）研究開発分担者：Wiriyasermkul Pattama（東京慈恵会医科大学・医学部・助教）
分担研究開発課題名：毒性ポリペプチドの新規標的分子の同定
研究開発成果：2018年度は、毒性ポリペプチドが細胞接着に影響を与えていることを示唆する結果を取得し、毒性ポリペプチドが結合する新規標的を探索する基盤となる細胞外局在タンパク質の分画精製技術が確立した。これらの結果を踏まえて、2019年度は、新規標的因子の同定を試みた。膜局在のタグの作製に時間を要したが、膜局在する条件を得た。毒性ポリペプチドを追加し系の確立を進めてきている。また、APEXよりも反応速度がより早く改良されたTurboIDを用いたシステムの導入を同時並行で進めた。哺乳類培養細胞を用いて毒性ポリペプチドを発現した場合、毒性ポリペプチドによる細胞毒性が出現することが明らかになった。このことを踏まえ、細胞内発現のみならず、培地中に組換えタンパク質として加える系を開始した。さらに、毒性ポリペプチドとKapβ2が相互作用することを受けて、Kapβ2の標的タンパク質の同定のために、Kapβ2にTurboIDを付けた系を樹立した。2020年度は、細胞膜に局在する細胞骨格制御に関わる因子に着目したところ、毒性ポリペプチドによって細胞間接着に係わる接着斑の構成因子であるERMとPAXILLINのリン酸化の増強を認めた。接着斑の構成因子は、細胞骨格のアクチンフィラメントと連動しており、細胞が硬くなったことと連動して、細胞間接着に影響を及ぼしている可能性が示唆された。また、ALS関連変異体を含むFUSフラグメントとKapβ2の結合定数を等温滴定カロリメトリー法（ITC）により解析したところ、Kapβ2は核移行シグナル（PY-NLS）以外とも相互作用することが示された。また、サイズ排除クロマトグラフィと多角度光散乱検出（SEC-MALS）の解析結果から、毒性ポリペプチドとKapβ2が1:1で結合していることが明らかになった。

（３）研究開発分担者：吉澤　拓也（立命館大学・生命科学部・講師）
分担研究開発課題名：毒性ポリペプチドとImportinとの相互作用の生物物理学的解析
研究開発成果：毒性ポリペプチドとKapβ2の熱力学的解析（ITC）と、Kapβ2と結合する毒性ポリペプチドによるKapβ2の機能阻害の評価（液-液相分離性、ポリマー形成性）を行った。その結果、毒性ポリペプチドがKapβ2のシャペロン能を阻害することが明らかになった。また、NMR法による検討を組み合わせることで、毒性ポリペプチドがKapβ2の核移行シグナル（NLS）結合部位に結合し、結果としてKapβ2がFUSのNLSを認識できなくなっていることも、明らかにした。さらに、高速AFMでの評価系の確立のために、基板上にDNAや脂質を用いて修飾を加える予備検討を進めた。2020年度は、NMR法による解析をさらに進めることで、毒性ポリペプチドがKapβ2の核移行シグナル（NLS）結合部位（陰性荷電しているcavity部分）に結合し、その結合部位がFUSのNLS結合部位と部分的に重複し、FUSのNLS以外の領域とは重複していないことが示された。また、核移行シグナルを模した合成ペプチドであるM9Mと毒性ポリペプチドがKapβ2の相分離抑制作用を示すことを、光学顕微鏡と濁度法により確認した。また、高速AFM（HS-AFM）によるFUSの動的解析を行い、基準となる構造を持つ領域を認識することに成功した。

（４）研究開発分担者：愛場　雄一郎（名古屋大学・理学研究科・准教授）
分担研究開発課題名：毒性ポリペプチドの効率的合成と標的分子との相互作用のin-silico解析
研究開発成果：2018年度から取り組んでいる毒性ポリペプチド合成の効率化・精製法の最適化を継続して進めており、特に2019年度は大スケールでの精製の効率化について検討を行った。特に、従来一般的であった高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による精製だけではなく、近年発表された低圧液体クロマトグラフィー用の逆相C18カラムを検討することで、精製スケールの向上を試みた。また、分子動力学計算（MD）を用いた毒性ポリペプチドと標的タンパクとの相互作用解析を行うことで、生化学的・構造生物学的な解析結果によって得られた結果を追試することに成功した。2020年度は、従来は室温でのみ稼働していた反応ブロックにヒーティングモジュールを導入することで、ペプチド合成時に加温することが可能となった。結果、加温することによる反応時間が短縮し、ペプチド合成効率の向上により、総合的にポリペプチド合成の効率を改善した。また、これまでの2年間で得られたNMR解析などの知見を基に、分子動力学（MD）計算により、毒性ポリペプチドと標的タンパクとの相互作用の解析を行った。その結果、生化学的・構造生物学的な解析結果によって得られた知見を追試することに成功した。さらに、アフィニティーカラムを用いた拮抗実験から、毒性ポリペプチドはKapβ2のNLS結合部位と部分的に競合することが明らかとなった。