【茶山一彰】研究代表者としての成果は以下の通りである。臨床系の班員である狩野班員、熊田班員、清家班員と茶山主任研究員のインターフェロン、direct acting antiviralによるSVRを得た患者の発癌とQOLの変化に関する要因を集計し、田中純子班員が統計学的な解析を行った。現在論文化に向けての作業を進めている。基礎的な解析を含めた研究では、daclatasvir　+asunaprevirで治癒に至らなかった症例に対して、daclatasvir+asunaprevir+veclabuvirの治療をおこなっても、多重耐性のウイルスが出現し、治癒が得られにくいことを明らかにした(Teraoka Y, et al. J Gen Virol. 2018)。これと比較して、同じdaclatasvir+asunaprevir の症例に対してledipasvir/sofosbuvir with ribavirinの投与を行う臨床研究を実施し、この治療では高率に治癒が得られることを報告した(Kawakami Y, et al. J Gastroenterol. 2018)。C型肝炎ウイルスの感染の発癌に対する影響を調べるために、未治療のC型肝炎C型肝炎患者、インターフェロンあるいはDAAでウイルス学的治癒が得られた患者の肝組織をChIP-sequencingとRNA sequencingにより解析し、非感染患者､B型肝炎およびNASHの症例の肝組織と比較を行った。またヒト肝細胞キメラマウスを使用してHCV感染の影響を調べた。その結果ヒストンのH3K27アセチル化とそれに伴うmRNAの増加がHCV感染により引き起こされ、インターフェロン、DAAによる治療によっても同じように消失しないことを示した。さらに、ヒト肝細胞キメラマウスでも同様の変化が生じていることを確認した。Genome wideのこれらの解析からSPHK1 の活性上昇が肝癌発症のリスク因子として重要であり、このことはさらに多数の未治療、既治療のC型肝硬変患者においても確認された。したがって、このようなepigeneticな変化は肝発癌の予防に重要であり、今後治療として考慮されるべきことを示した(Hamdane N, et al. Gastroenterology. 2019)。各班員の成果は以下の通りである。【立野知世】昨年度に引き続き、ヒト肝細胞で置換された肝臓を有するPXBマウスを用いて、感染早期のHCV RNAの血中動態を明らかにし、HCV RNA動態解析におけるPXBマウスの有用性を検証することを目的とした。ヒトに近い実験動物を用いたHCV RNAの血中動態の解析は、患者では検証出来ない感染早期のHCV RNAの動態解析も可能になることから、DAAの治療効果や治療期間の予測などに有用であると考えられる。PXBマウスおよびSCIDマウスにHCVを投与し経時的に採血を行い、血清中のHCV RNA titerを測定した。その結果、PXBマウスでのみ接種後に体重の減少が認められた。PXBマウスとSCIDマウスで、感染後超急性期(30～60分後)のHCV titerの減少率に明らかな差が認められた。接種後6時間後には、全ての個体で定量下限以下、もしくは陰性化したが、PXBマウスでは接種翌日に明らかなウイルス量の増加を認め、4日目に2/5匹においてスパイクが見られた。少なくとも、接種後6日目までの対数増幅期と、その後の直線的な増幅期の2相が存在すると予想された。今後、これまでに報告されているヒト臨床データやチンパンジーのデータと比較するために、共同研究者により数理モデルを用いてHCVの半減期や倍加時間等を解析し、従来の結果と比較する予定。【本多政夫】これまでにSVR後発癌症例の背景肝組織を用いたメチル化アレイ解析からSVR後発癌と関連するTMEMファミリー遺伝子Xを同定した。遺伝子XはSVR後発癌症例の背景肝で非発癌症例より高発現を示した。また肝癌組織では背景肝組織より発現の増強が認められた。遺伝子Xは肝の類洞や血管内皮といった間質に発現していた。しかしながら、血管内皮細胞マーカーであるCD34や筋線維芽様細胞で発現するα-SMA陽性細胞の発現とは必ずしも一致しなかった。遺伝子Xの発現は炎症、線維化のスコアと有意に相関し、肝癌の再発や予後と有意に相関した。以上より、遺伝子Xは炎症・線維化・肝発癌の新規バイオマーカーとなり得る可能性が示唆された。遺伝子Xを過剰発現した血管内皮細胞Huvecを用いて、mediumを灌流させる装置を作成し、細胞にshear stressを負荷すると、IL6やIL8などの炎症性サイトカインの誘導が認められた。また、それらの誘導は遺伝子Xのノックダウンによって抑制された。遺伝子Xの細胞内での局在はERであり、ERストレス応答に重要な分子であるBiPやATF6と結合していることが免疫沈降や蛍光染色によって示された。siRNAによる遺伝子XノックダウンによりBiPやATF6の発現が抑制され、遺伝子XはBiPやATF6の安定化に関与している可能性が示唆された。このように、新規メチル化変動遺伝子遺伝子XはERストレスをよく反映し、炎症・肝線維化の新規マーカーであるとともに、SVR後肝発癌及び肝癌の予後マーカーとして有用である可能性が示唆された。【土方誠】HCVの発癌機構の解析をおこなう目的で、野生型の遺伝子型1bHCV（HCV1b）が培養非がん細胞内で持続増殖する培養系の開発を目指した。これまでにHCV感染増殖培養実験に用いられているHCV1b株は、肝がん由来の培養細胞でのみで増殖することが可能なもののみであった。これらの株のRNAゲノムには、この細胞に適応した変異が存在しており、適応変異型HCVと呼ばれていた。これらの適応変異は自然界、つまり感染患者には認められておらず、またこの変異を導入したHCVは感染モデル動物であるチンパンジーでは増殖しないことが知られていた。まず、野生型と適応変異型のHCVの相違を検討するため、これまでに樹立していた、双方のHCVが増殖することが可能なSEC14L2恒常発現細胞に、野生型と適応変異型KT9のサブゲノムレプリコンを一過性に導入するHCVゲノム複製モニター系を用いて、種々の抗HCV薬剤に対するそれぞれの感受性を検討し、野生型KT9の方が各薬剤に対する感受性が低いことを見出した。また野生型株は適応変異型に比べると著しく複製効率が低いことがわかった。しかし、同じ野生型KT9サブゲノムレプリコンが恒常的に複製しているレプリコン細胞では、その複製効率が適応変異型と比較して同程度であることがわかった。このことからこの細胞では野生型HCVの継続的な複製により、細胞側に何らかの変化が生じ、野生型HCVの増殖に有利に働いている可能性が考えられた（論文受理）。これらの変化については現在、HCVゲノム導入後の経時的な細胞の遺伝子発現変化の解析を進めている。また一方、非がん細胞である不死化肝細胞であるHuS-E/2細胞に野生型KT9ゲノムをテトラサイクリンによる発現制御下で行う細胞株の樹立を進めており、今後、長期HCV複製を維持させることによる非がん細胞に生じる種々な変化を検出する予定である。【高倉喜信】本年度は、C型肝炎ウイルス（HCV）感染時における発がん過程における細胞外小胞（EV）の役割を明らかとすることを目的として、HCVに感染したヒト肝細胞キメラマウスの血液サンプルから、これまでの検討にて確立したか再現性が高く血中から高純度のEVを回収可能な方法を用いて回収したEVについて、含まれるタンパク質を質量分析に基づくプロテオミクス解析により解析した。その結果、HCV感染したヒト肝細胞キメラマウスの血液中EVにおいて、いくつか発現が上昇しているタンパク質を見出した。それらのタンパク質について、詳細に検討をも、プロテアソームに関係した何種類かのタンパク質の発現の上昇が観察された。さらに、プロテアソーム感受性蛍光標識ペプチドを用いて、プロテアソーム活性を測定したところ、HCV感染したヒト肝細胞キメラマウスの血液中EVは、非感染マウスの血中EVより高いプロテアソーム活性を示した。プロテアソームを含んだEVが免疫細胞に取り込まれることで、免疫細胞の活性化が抑制されることが報告されていることから、HCV感染による血中EVのプロテアソーム活性の上昇は、HCV感染後の増悪と発がん過程において、EVによる免疫抑制の可能性を示すものと考えられる。【前川伸哉】1. レーザーマイクロダイセクションと次世代シークエンシング技術による大規模網羅的遺伝子解析 ・ C型肝炎SVR 後肝癌における肝癌ゲノム変化の特徴を明らかにするために、C型肝癌40例(SVR13例) 、B型肝癌13症例、非B非C型肝癌13症例における117結節を対象に癌関連51遺伝子を標的とした次世代シークエンスあるいはデジタルPCRを継続解析した。興味深いことに腫瘍組織内におけるhTERT変異細胞の占める割合は、腫瘍の進展度に拘わらず約30％前後であることを示した。2. 肝炎ウイルス制御下の病変進展・肝発癌におけるウイルスゲノムの解析・ DAAによるSVR症例において、治療前のウイルスゲノムと治療後の肝発癌の関連を検討し、治療前コア70番変異型に加え、IL28BTT(メジャー群)を有する症例では、SVR後でも特にHCCが出現しやすいことを示した。3. SVR発癌リスク評価のための血液バイオマーカーの開発・ 血液を用いたリキッドバイオプシーにより、デジタルPCRを用いた血漿中のhTERT C228Tの定量検出システムを構築。腫瘍の進展に応じて、C228T変異遺伝子の定量的検出率が上昇することを示した。特に肝癌におけるTACEあるいはTKI等の化学療法における治療効果のモニターとして用いうることを示した。・ 一方、デジタルPCRを用いた血液中の変異定量検出システムでは予め変異のターゲットがhTERT C228Tに限られるが、一部の肝癌で予め変異が明らかでない場合においても、血液を用いたリキッドバイオプシーから、網羅的な変異検出によって、変異の種類の同定が可能であることを示した。【松浦善治】HBV既往歴のあるHCV患者に対してDAA治療を行うと、HBVが再燃する事例が報告されている。そこでHCVの排除によるHBVの再活性化メカニズムを調べるために、DAAの直接的または間接的なHBV増殖への影響を調べた。HCVのNS3、NS5A、NS5Bの阻害効果を持つDAA処理によるHBV増殖への影響は認められなかったため、HCVが排除されることにより間接的にHBV増殖が再活性化されるという仮説を立てた。そこで我々はまず、ウイルスや宿主のタンパク質を分解するHCVのプロテアーゼNS3/4Aに注目した。HBV-HCVの共感染モデルとして、HCV NS3/4Aを発現させた肝臓細胞にHBV発現プラスミドを導入したところ、HBVコアタンパク質を分解することを見出した。さらに、細胞内のHBV rcDNA量も減少しており、HCVの排除によってHBVコアタンパク質が分解を逃れることで再燃に寄与している可能性が示唆された。一方、NS3/4Aのプロテアーゼ活性を欠損させた変異体NS3/4A（S139A変異体）を用いるとHBcの分解は抑えられたが、完全にはrcRNA量は回復しなかった。よって、NS3/4Aにはプロテアーゼ活性の他にヘリカーゼ活性や核移行能があるが、それらの機能もHBV増殖抑制に寄与していることが示唆された。【大段秀樹】DAA登場以前のC型肝炎肝移植後のIFN療法は、SVR率がわずか31.0% (58症例)であった。DAA登場後の３剤併用療法(PEG-IFN+RBV+TVR/SMV)によりSVR率は66.7%/85.7% (3症例/7症例)へと向上した。2014年以降IFNフリーのDAA治療を開始している。SVR率はDCV/ASV 88.9% (8/9例)、SOF/LDV 100% (5/5例)、SOF/RBV 100% (2/2例)、GLE+PIB 100% (6/6例)と非常に良好であった。DCV/ASVでSVRが得られなかった1例はD168 mutantであった。DAA治療が免疫抑制剤投与状況及び薬物血中濃度に与える影響を評価した。また、レシピエントの免疫状態に与える影響を解析するため、レシピエント末梢血のリンパ球混合試験を行った。３剤併用療法(PEG-IFN+RBV+TVR/SMV)療法では、レシピエント末梢血のドナー血球に対する応答が治療前と比較して亢進（CD4 T細胞のstimulation indexが1.42から2.32と上昇しており、基準値の2を超える拒絶反応を示唆する所見であった）していた。一方、IFNフリーDAAでは抗ドナー応答亢進の所見は認めず、免疫抑制剤用量調整がほぼ必要なかった。DCV/ASV（10症例）では、貧血（2症例）、発疹（2症例）、帯状疱疹、好中球減少、下痢、気管支炎、めまい（各1例）を認めた。SOF/LDV（5症例）ではカリニ肺炎（1症例）、SOF/RBV（2症例）では貧血、帯状疱疹（各1症例）、GLE+PIB（6症例）では、貧血、掻痒感（各1症例）を認めた。いずれにおいても治療による急性拒絶反応を認めなかった。以上より、HCVに対する肝移植後のIFNフリーDAA療法は、SVR率が高く、重篤な副作用を認めなかった。また、移植後の免疫状態に与える影響は少なく安全に使用可能と考えられた。【河岡友和】当院にて後ろむきに調査の行えたHCV症例でSVR後ALT高値の患者をまとめた．人数は408例であった．性 (男性/女性)：175/233，Genotype (1/2)：275/133，SVRからの期間38ヶ月．ALTは治療前30IU/L，SVR24週では16，38ヶ月は15まで改善していた．現在，ALT以上割合は3.1%であった．SVR後 ALT>40群 (n=21)の原因の考察としてはDMが33%，アルコール19%，脂肪肝19%，NASH14%であった．SVR後 ALT>40群に寄与する因子としてはgenotyoe2，年齢 (<60)，DAA前ALT高値が関与していた．SVR24時 ALT正常から高値へと移行した症例は生活習慣病が多くみられた．SVR後にもALT高値の症例は少なからず存在する．そのような症例には生活習慣の是正が今後必要になると考えられた【三木大樹】三木班員がSVR症例3771例を検討した結果、PNPLA3やHLA-DQB1といった宿主の遺伝的要因がSVR後の新規発癌に関連することが示唆された。一方、TLL1については関連が見られなかった。【今村道雄】多施設共同研究により、DAA既往歴のある54例のC型慢性肝炎患者に対するグレカプレビル＋ピブレンタスビル再治療の効果を明らかにし、治療不成功例における薬剤耐性変異のプロファイルを明らかにした。ヒト肝細胞キメラマウスを用いてNS5A-P32del変異型HCV感染マウスはグレカプレビル＋ピブレンタスビル治療に極めて高い抵抗性を有しているが、NS5A-P32delの頻度が低ければ同治療によりHCV排除が可能となることを見いだした。DAAによるSVR後の肝発癌リスクはIFN治療によるSVR後発癌リスクと同程度であること、DAAによるSVR獲得が肝発癌低下効果は、慢性肝炎患者に比べ肝硬変患者においてより強いことを明らかにした。【芥田憲夫】1) C型肝炎IFN freeレジメンの治療効果別に見た肝発癌率と肝疾患関連死亡率を検討した。更に、肝発癌リスクの高い肝硬変症例に絞った検討も行った。結果的に、C型肝炎IFN free レジメンのSVR例では肝発癌率と肝疾患関連死亡率は共に低下することが確認された。2) 実臨床で有用なSVR後肝発癌リスク因子を多数例で検討した。更に、肝発癌リスク因子とウイルス、宿主要因との連関を検討した。結果的に、SVR後肝発癌リスク因子として肝硬度とAFPが実臨床で有用な指標となった。これら指標はウイルス・宿主要因と関連を示唆する所見が確認された。3) SVR後の肝硬度推移から門脈圧亢進症へのインパクトを検討した。結果的に、肝硬変でSVR後でも肝硬度が悪化する症例は門脈圧亢症の増悪に注意を要することが確認された。【狩野吉康】After the achievement of sustained virological response by direct acting antivirals, does the age influence the recovery of the hepatic reserve? DAA治療の出現により大部分のC型肝疾患においてHCVの完全駆除が可能になり、SVR達成後の肝予備能の改善が報告されている。我が国ではC型慢性肝疾患患者の平均年齢が約70歳であり、高齢者を治療する機会が多い。そこで我々は肝予備能の改善に関与する因子、特に年齢が肝予備能の改善に関与するか否かを検討した。方法 : 対象はDAA治療でSVR達成後3年以上経過観察が可能であった403例(male: 164, female: 239, genotype 1:299, 2:104, median age 69 years old)である。このうち75例（18.6%）は肝癌の既往があった。血液生化学検査を経時的に行い、ALBI gradeから肝予備能を評価した。生化学検査を行い、肝予備能はALBI scoreからgrade 1：< -2.60、grade 2：< -2.60 to < -1.39, grade 3： >-1.39に分け評価した。年齢から3群（A:64歳以下、B:65~74歳、C:75歳以上）に分け年齢、DAA治療開始時の血液生化学検査、CTによるportosystemic shuntを含む背景因子の肝予備能改善に及ぼす影響を検討した。結果: 治療開始時のALBI gradeはgrade 1:241例、grade 2:157例、grade 3:5例であり、3年後にはgrade 2または3の162例中117例（72％）でgrade 1へ改善を示した。多変量解析ではgrade 1への改善を阻害する因子はSVR達成後のHCC発症有り（HR:3.08 P<0.0138）、男性（HR:3.45 P=0.0143）、Hb＜10.5ｇ/dl（HR:4.19 P=0.0157）、portosystemic shunt有り（HR:3.07　P=0.0349）、ALT＜45U/L（HR:2.67　P=0.0425）であった。結論：肝癌発症、男性、Hb低値、portosystemic shunt、ALT低値は肝予備能改善を阻害する因子であった。一方、年齢（高齢）は阻害する因子ではなかった。すなわち高齢者においてもHCVが駆除されれば肝予備能の改善が期待できる。【田中純子】(1) 抗ウイルス療法によるSVR後のQOLの変化について明らかにするために、研究の得られた5つの医療機関において1990年1月1日～2017年3月31日にC型肝疾患に対し抗HCV治療を実施し、ウイルス排除ができた以下の成人患者13,359症例のうち、調査参加の同意を得た1723症例を対象に治療前後のQOLおよび対象者背景4項目に関するアンケート調査を行った。その結果、図に示すように、IFN治療SVR例の60-70歳代、DAA治療SVR例の50-60歳代についてSVR後のQOLスコアの有意な改善が認められた。(2) 分担研究者が属する5つの医療機関において抗HCV治療を実施しウイルス排除ができた成人患者5,606名の患者情報を用いて、SVR後の発癌要因について、探索的解析（ログランク検定、プロペンシティスコアで背景要因をマッチングさせ要因別の発がん率の比較）を行った。ログランク検定（単変量解析）の結果、男性、SVR時年齢高齢、Fib-4>3.15、脂質異常なし、AST>30、γ-GTP>50、Alb>4、AFP>10である群はそうでない群よりもSVR後発がん率が有意に高く、プロペンシティスコアマッチング後の解析では、男性においてSVR後発がん率が高い傾向が認められた。また、SVR後N年無発がんにおける累積発がん率を推計したところ、経年とともに発がんのリスクは低下する傾向が認められた。さらにSVR後5年間の発癌の有無を、4種類のSNP（IL28/TLL1/HLA-DQB1/PNPLA）のうちの一つ、および性別、Alb、PT活性、FIB-4indexの合計5項目で予測する「予測式」を4通り推定したところ、特異度が最も高いものはHLA-DQB1を用いた予測式であり、感度が最も高いものはTLL1を用いた予測式であった。【相方浩】抗HCV療法によるウイルス排除により肝発癌抑制効果および肝癌治療後再発抑制効果が得られることを後方視的解析により確認した．一方，肝硬変例ではHCV排除後も食道静脈瘤が増悪する症例が存在する．とくに，抗HCV療法施行時，すでに門脈体循環シャント発達症例など，一定以上に門脈圧亢進症が進行している症例では，SVR後の門脈圧亢進症改善効果は限定的な可能性があり，今後さらに検証する必要があると考えられた．【熊田卓】本邦においてもC型非代償性肝硬変に対する抗ウイルス療法が認可され使用が可能となった。一方海外では認可当初からDAAの非代償性肝硬変治療が可能で多数例に使用されてきた。今回われわれはイギリスの｢HCV Research UK｣から非代償性肝硬変のDAA治療のデータベースを得たので当院の非代償性肝硬変と予後を比較した。対象は｢HCV Research UK｣からの653例中SVRが得られSVR後1年以上発癌の無かった439例（SVR群）と当院でC型肝炎と診断された6,638例中非代償性肝硬変と診断され診断後1年以上発癌がなくウイルスの持続感染が確認された621例(持続感染群)の計1,060例である。これらの症例の肝疾患関連死、肝疾患非関連死について競合リスクモデルを用いて解析した。背景因子では年齢は71歳（64-77、以下4分位範囲）と持続感染群で17歳、有意に高齢で、大酒家率49.9％、喫煙率75.1％、BMI 27.3kg/m2(23.9-31.1)、FIB-4 index 7.80(4.95-12.74)はSVR群で有意に高率・高値であった。Child-Pugh分類、ALBI gradeは両群間で差を認めなかった。持続感染群はSVR群に比してハザード比（HR）2.492（95%信頼区間[95％CI] 1.895-3.277）と有意に死亡率は高かった(p＜0.0001)。一方肝疾患関連死、肝疾患非関連死も持続感染群でHRはそれぞれ3.371（2.110－3.584）、2.168（1.559－3.016）といずれもSVR群より高かった（p＜0.0001）。Child-Pugh分類別にみると、肝疾患関連死は、A、B、Cでそれぞれ持続感染群のHRは1.982（0.2404－16.34）、2.831（1.694－4.734）、9.68（2.374－39.48）とBとCでSVR群より高かった（p＜0.0001、p＝0.0015）。一方、肝疾患非関連死はA、B、Cでそれぞれ持続感染例のHRは3.399（0.7704－14.99）、2.403（1.643－3.516）、1.37（0.6349－2.9868）とBでSVR群より高かった（p＜0.0001）。3年の短期間の観察ではあるが非代償性肝硬変でのウイルスの除去は肝疾患関連死に関しては、Child-Pugh分類BとCに、肝疾患非関連死ではBに効果が見られ重症例に、より積極的に施行すべきと考えられる。【本田浩一】（背景）進行肝疾患において骨格筋量の減少は予後に関わる問題点の一つであるが、C型肝炎治療SVR後の体成分組成の変化については明らかでない。本研究ではIFN-free治療SVR後の長期的な体成分組成について観察し、その変化に寄与する因子について解析した.（方法）IFN-free治療SVR後患者152名を対象とし、BIA法（InBody770）を用いて体成分組成を前向きに観察した。3ヶ月後（143名）、9ヶ月後（127名）、2年後（99名）の体重、体脂肪量、体水分量、骨格筋量に関わるパラメータについて、治療前(n=152)のデータと比較し、有意な変化について解析した。また,血小板数10万/μL未満の肝硬変患者42名についても同様な解析を施行した。（結果）3ヶ月、9ヶ月では全てのパラメータに有意な変化を認めなかったが、2年後では体水分量（30.5±6.0 vs 30.3±6.0L,p=0.004、細胞内水分量(18.6±3.7 vs 18.4±3.8L,p=0.016),細胞外水分量(11.9±2.2 vs 11.8±2.2L,p=0.019),骨格筋量(22.3±4.9vs 22.1±4.9kg,p=0.018)の減少および体脂肪量(16.1±7.0 vs 17.1±6.7kg,p=0.001),体脂肪率(27.5±9.1 vs 28.9±8.8%,p<0.0001)の増加を認めた。肝硬変患者の骨格筋量は治療前23.1±5.0kg、 2年後22.8±5.2kg(n=27)であり、減少率は0.65%/年であった。（結論）HCV排除後、長期的には体脂肪量が増加し、骨格筋量は減少した。しかし、肝硬変患者における骨格筋量減少率は既報より低く、ウイルス排除による骨格筋量減少抑制効果が示唆された。