【谷口正実　独立行政法人国立病院機構相模原病院】
（背景）アスピリン喘息（AERD）は、成人喘息の１０％を占め、かつ重症喘息の代表病型であり、NSAIDs誤使用による医療事故も少なくない。国内外でその病態や機序の解明や特異的治療薬の開発が待たれている。
（目的）
１） AERDの機序の解明と特異的治療薬の開発
２） NSAIDs不耐症の診療の手引き（国際版）の完成と公表
（成果の概要）
１）アスピリン喘息（AERD）のNSAIDs感受性を消失させる薬剤の発見
すでに、Omalizumab（抗IgE抗体、ゾレア(R)）が、ほとんどのAERDの臨床症状を顕著に改善するだけでなく、基本的病態である「システィニルロイコトリエン過剰産生」と「マスト細胞持続活性化」を正常レベルに改善することを見出していた（Hayashi Taniguchi et al. JACI2016）。その後、これらの結果を受けて、偽薬を用いたクロスオーバー試験にて、Omalizumabの規定量を月1回ｘ3回投与するRCTを施行した。この結果、Omalizumab投与群では、主となるメディエーター産生亢進の抑制だけでなく、アスピリン感受性を60％以上の症例で消失させることが判明した（Hayashi Taniguchi et al. AJRCCM 2020）。この効果は、非AERDをはるかに超えた効果であり、特異的ともいえるため、その機序の解明することがAERDの機序解明につながると考えた。2019年度では終了しなかったが、引き続きmRNAやサイトカインなどの網羅的解析により、Omalizumabの効果を検証し、AERDの基本的病態を解明中である。またOmalizumabのAERDに対しての適応拡大に向けて、今後国内外で進めていく予定である。また臨床現場における重症AERDに対する決定的な治療薬となるため、医療現場や患者に大きな貢献が期待される。
２）欧州タスクフォースに参加し、共同作業により、診療の手引きを完成し、公表した（Allergy 2019）。

【成宮周　国立大学法人京都大学】
アトピー性皮膚炎は喘息と同様type 2型のアレルギー炎症であるが、アスピリンなどのNSAIDsは往々にしてアトピー性皮膚炎などの皮膚炎症を誘発、増悪する。このことから、本年度は、アトピー性皮膚炎モデルをもちいてここでのアスピリン不耐性のメカニズムを解析した。ハプテンを用いてアトピー性皮膚炎を発症させたマウスにインドメサシンを投与すると、皮膚でのTSLPおよびIL-33の増加とともに血清IgEレベルの高値を来たし皮膚炎の増悪を見た。この増悪と皮膚でのtype 2型アレルギー反応はTSLP受容体欠損で抑制された。このモデルとして培養角化細胞を用いて実験したところ、インドメサシンはPAR2受容体を介する角化細胞のTSLP産生を亢進し、この亢進はPGE2投与によりEP2受容体依存性に抑制された。このIn vitroの所見をもとに、in vivoモデルでEP2アゴニストを投与したところ、インドメサシン投与によるTSLPの増加とtype 2アレルギー反応は抑制され、反対にEP2アンタゴニスト投与によりTSLP増加とアレルギー炎症の増悪がみられた。以上のことから、皮膚ではPGE2-EP2経路がアレルギー炎症の抑制に働いていること、NSAIDsはこの経路を阻害してアレルギーの増悪に働いていることが示唆された。

【清水孝雄　国立研究開発法人　国立国際医療研究センター】
本研究課題では、より網羅的な脂肪酸代謝物解析を行うため、測定する分子数をこれまでの127種類から158種類へ増やす検討を行なった。新たに測定項目へ加えた代謝物は、これまでのアラキドン酸代謝物を中心としたものに加えて６種類のEPA代謝物や5種類のDHA代謝物などである。測定は超高速トリプル四重極型質量分析計LCMS-8060(島津製作所)を用いて、各希釈液5μLを注入し行なった。その結果158種類の代謝物について、0.01～100 pg/μLの間で測定が行える超高感度定量条件を確立した。この手法を用いて、尿検体から14種類の脂肪酸代謝物（LTE₄, PGE₂, 15-keto-PGE₂, 13, 14-dihydro-15-keto-tetranor-PGE2, tetranor-PGEM, 11-dehydro-TXB₂, PGF_2α、, 8-iso-PGF_2α、, 8-iso-15(R)-PGF_2α、, tetranor-PGFM, tetranor-PGDM, 13, 14-dihydro-15-keto-tetranor-PGD₂, 2,3-dinor-8-iso-PGF_2α、, 5-iPF_2α VI）を測定できることがわかった。次に、安定期アスピリン喘息患者および喘息患者、健常者から回収した尿の測定を行なった。0.4 ml 尿よりOasis HLBカラム（waters）を用いてサンプル精製を行い、回収したサンプルを減圧乾燥後20 μLメタノールへ再溶解した。このうち5 μLをLCMS-8060を用いて測定した。安定期アスピリン喘息患者２１名、喘息患者８３名、健常者１０名の測定を行ったところ、これまでの報告と同様にアスピリン喘息患者において、LTE4が増加していることが確認できた。

【北芳博　国立大学法人東京大学】
ＡＥＲＤの病態機序の解明を目的として実施した「アスピリン喘息に対するオマリズマブの有効性に関する二重盲検ランダム化臨床比較試験」において採取された、オマリズマブ投与およびアスピリン負荷時の被験者尿検体（全224検体、３回ずつの繰り返し測定による総数672の分析データ）について、昨年度までにLC-MRM-MS法によるエイコサノイド類の一斉定量測定を実施し、検出された約50の成分のうち、オマリズマブ投与後のいずれかの時点で、対照群（プラセボ投与）と比べて有意に増加または減少している可能性のある脂質メディエーター成分を複数（7～15成分程度）見出していた。今年度は、このデータについてさらに追加の統計解析を試みたが、追加の知見を得るには至っておらず、引き続き検討する必要があると考えている。一方、本研究課題においては、患者尿検体を効率的にリピドーム分析するために検体の新規前処理法を開発した。この手法は、従来、脂質代謝物の抽出にはほとんど用いられることのなかった支持液抽出（SLE）法を条件を最適化することにより、尿や血液などの液体検体からの脂質メディエーター類の迅速で効率的な抽出を可能としたものであり、今年度はその成果をJ Chorm B誌に論文として発表した。

【廣田朝光　学校法人慈恵大学】
アスピリン喘息/NSAIDs不耐症患者の遺伝的背景の解明を目的とし、候補遺伝子アプローチによる症例対照関連解析を行った。候補遺伝子は、NSAIDs不耐症で高率に合併する鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎において関連の認められたもの、また、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症などのアレルギー疾患のGWASで関連の認められたものなど、およそ52の遺伝子多型について関連解析を行った。関連解析の結果、16q12のNOD2, CYLD遺伝子を含むゲノム領域、および、5q31.1のIL13遺伝子を含むゲノム領域の遺伝子多型について、アスピリン喘息/NSAIDs不耐症患者との有意な関連を認めた。
NOD2, CYLD遺伝子を含む16q12のゲノム領域に存在する関連の認められたrs1861760は、in silicoの解析で末梢血中のNOD2遺伝子発現量と相関を示すeQTL (expression quantitative trait loci)であることが示され、NOD2遺伝子は、ヒト組織において皮膚、抹消血、脾臓、食道、肺などに特異的に発現していることが確認された。また、rs1861760はいくつかの転写因子の結合を変化させることが示唆されるため、rs1861760はNOD2遺伝子の発現量を調節することによりアスピリン喘息/NSAIDs不耐症の病態に関与することが示唆された。
5q31.1のIL13遺伝子を含むゲノム領域のにおいて、既に遺伝子の機能的変化が報告されているアミノ酸変異を伴うrs20541 (R144Q, P = 1.88 × 10^-4)と、これとは連鎖不平衡が弱く、独立に関連すると考えられる遺伝子上流のrs1881457 (P = 2.48 × 10^-4)において同等の強い関連を確認した。rs1881457は、ヒストンのメチレーション、アセチレーションの情報からプロモーターまたはエンハンサーとしての機能することが示唆され、遺伝子発現量を調節している可能性が示された。欧米人と異なり東アジア人(中国人、日本人)では、rs1881457は強い連鎖不平衡(r² > 0.8)を示す遺伝子多型が認められないため、日本人において、この遺伝子多型そのものが遺伝子の量的な変化に関与している可能性が示唆された。

【藤枝重治　国立大学法人福井大学】
アスピリン喘息/NSAIDs 不耐症に合併する好酸球性副鼻腔炎に関して検討した。好酸球性副鼻腔炎では、好酸球の能動的な細胞死 （EETosis）が鼻汁粘液の粘性を増強し，クリアランスを障害し，シャルコー・ライデン結晶の形成などに寄与しており，炎症増幅に関与していた。
鼻茸には、炎症に関連するHEV様血管が誘導されており、その内皮上末梢リンパ節アドレシン（PNAd）が存在していた。PNAdは好酸球上の L-selectinと結合するが、鼻茸への好酸球浸潤には
PNAdとL-selectinの相互作用が重要であることが判明した。
また鼻茸組織では、凝固系の亢進と線溶系の抑制が起こり、フィブリン網が沈着しているが、その原因として鼻茸組織中と鼻腔洗浄液中のトロンビンとthrombin activatable fibrinolysis inhibitor（TAFI）が健常者と比較して有意に高いこと，特に気管支喘息を合 併する患者で高いことを見出した。このことから、今後トロンビンを標的とした治療戦略の構築が可能となってきた。
好酸球性副鼻腔炎の臨床マーカーはまだ確立されていないが、血清中IgG4とペリオスチンの組み合わせによって、術後の再発が予測できることが判明した。今後、臨床応用が期待できる。IL-4受容体α鎖抗体の国際臨床研究が行われ、有意な鼻茸の縮小が認められた。本邦での対象症例はほとんど好酸球性副鼻腔炎であったが、50例の症例も他国の症例と同様に非常に効果があり、今後重要な治療法となると予測される。

【岡野光博 学校法人国際医療福祉大学】
まず、アスピリン喘息を合併する副鼻腔炎におけるIgG4の意義づけについて検討した。前年度までに、IgG4陽性細胞の局所発現について検討を行い、鼻茸におけるIgG4陽性細胞は鉤状突起粘膜に比べ有意に多く、さらにアスピリン喘息を合併する鼻茸でのIgG4陽性細胞数は、アスピリン耐性喘息例の鼻茸と比較しても有意に高いことを明らかにした。一方、バイオマーカーの材料としては組織よりは血液の方が適している。そこで本年度は血清IgG4のアスピリン合併副鼻腔炎における意義づけを行なった。その結果、中等症から重症の好酸球性副鼻腔炎患者では、軽症以下の好酸球性副鼻腔炎患者に比較して、血清IgG4が有意に高値を示した。さらにアスピリン喘息を合併する副鼻腔炎患者ではアスピリン喘息を合併しない患者と比較して血清IgG4濃度が有意に高値を示した。血清IgG4のカットオフ値を95mg/dLとすると、術後の再発を予測できる可能性が示された（感度39.7%、特異度80.5%）。さらに血清IgG4と血清ペリオスチンを組み合わせることにより、より術後の状態を予測できることが示された。
アスピリン喘息の原因のひとつとして、ウイルスの関与が注目されている。そこで今回は、アスピリン喘息を合併する副鼻腔炎患者（n=6）の鼻茸におけるウイルス叢（EBV, CMV, ParvoB19, HSV1, HSV2, VZVなど19種）をアスピリン喘息非合併喘息患者（n=7）の鼻茸と比較した。アスピリン喘息を合併しない患者の鼻茸では7例中6例でウイルスを検出したのに対して、アスピリン喘息を合併する鼻茸ではウイルスの検出は6例中3例であった（P=0.164）。特にEBウイルスについては、有意な差は認めなかったが（P=0.135）、アスピリン喘息を合併しない患者の鼻茸では7例中4例でEBウイルスを検出したのに対して、アスピリン喘息を合併する鼻茸でのEBウイルスの検出は6例中1例に留まった。これらの結果からは、症例数を増やした検討が望まれるものの、EBウイルスの曝露がアスピリン喘息の病態に何らかの関与を示す可能性が示唆された。

【磯谷澄都　学校法人藤田学園・藤田医科大学】
1) AERD診断後のNSAIDsの誤投与症例における問題点の解明
【背景・目的】AERD患者でNSIADsの誤投与が確認された症例は徐々に蓄積し18例となり、その背景、症状、転帰などに関し検討する。【方法・対象】18症例について診療録から臨床情報を後ろ向きに取得した。【結果】薬の材形は貼付薬12 例,錠剤3例,その他3例。処方診療科は整形外科10例,歯科・内科が2例,その他3例。12例が受診していなかったが、6例が救急受診、そのうち1例は重積発作であった。誤投与の原因として1)アスピリン以外なら大丈夫との誤認識2) 湿布なら大丈夫とする誤認識3) 診療録上でAERDの情報が伝わらない事などが考えられた。【考察】重要なのはまず医療者の患者への適切で慎重な説明（情報提供）、ついで医療連携で、院内、院外ともに適切に情報を伝えなければならないと考えられた。
2) アスピリン喘息患者に対するセレコキシブ負荷試験前後の尿中の各種メディエーターの変動についての解明
【背景・方法】 AERDでは選択的COX-2阻害剤のセレコキシブなどは安全性が高いといわれている。ただ一部で、セレコキシブにより一秒量や尿中leukotriene E4(LTE4)の増加を認めた症例も存在する。AERDの診断後、セレコキシブ内服負荷試験の前後での各種メディエーターを測定し、AERDの一部になぜセレコキシブに反応する症例が存在するのかを解明する。方法はAERD患者にセレコキシブ内服試験を施行し、内服前後に採尿を施行しえた9症例においてLipoxinA4, PGE2については前回までに報告し明らかな前後での変化は認めなかった。今回、 p-selectin , LTE4を新たにELISAkitにて測定した。
【結果】
セレコキシブ内服試験前後で
p-selectin(ng/ml) 前0.024±0.018(SD)、 後　0.021±0.014(SD)、
LTE4 (pg/ml)　前0.207±0.067(SD)、 後　0.184±0.050(SD) であった。
ともに内服前後で統計学的に明らかな変化は認めなかった。
【考察】AERDにおけるセレコキシブ内服によるmediatorsの変化は基本的に認めないとされる。今回測定したメディエーターも含め、セレコキシブ内服試験前後でLipoxin、PGE2, p-selectin, LTE4において明らかな変化は認めかなった。既報どおり選択的COX-2阻害剤でAERDを惹起させるようなメディエーターの変動はなくセレコキシブはAERDに関し安全である可能性が高いと思われた。

【佐々木 貴史　学校法人慶應義塾】
DNAウイルス高感度検出及び定量をおこなうため、これまでに次世代シーケンサーを用いた高感度解析系を構築した。この方法では数分子からでも検出が可能ではあったが１サンプルあたりのコストが20万と高価なため、本研究では、より安価なDNAウイルス高感度検出及び定量の構築を目指した。未知・既知両方のDNAウイルスを検出を行うために、Whole genome amplification(WGA)を用いたDNA増幅と次世代シーケンサー及び定量PCRによる検出を検討した。しかし、WGAでは微量サンプルの定量的増幅が困難であり、また非常に高い増幅バイアスがかかるためウイルス10コピー程度のサンプルを含むヒトゲノムからウイルスを含めて増幅することができなかった。次に特定のウイルスに対し高感度・高精度であるデジタルPCR(dPCR)をもちいたDNAウイルスの検出法を検討した。dPCRでは1サンプルあたり10分子程度までは定量的に検出可能であったが、それ以下ではシグナルとノイズの区別をすることが困難であった。また、定量対象領域とヒトゲノム領域をPCR増幅後に小型次世代シーケンサーを用いて配列の確認と定量する方法の検討し、定量限界はdPCRよりも5倍程度良いと考えられたが、PCRプライマーセットごとに増幅効率が異なることから正確な定量には検量線が必要であり煩雑であることから実用化は難しいと判断した。最終的に未知のDNAウイルスもしくは複数のDNAウイルスの検出・定量には次世代シーケンサーが、既知ウイルスの検出・定量にはdPCRが定量性が高いことを明らかにした。これらの結果、解析を行った血漿及び鼻茸組織78サンプルより、HHVウイルスを23サンプル、パルボB19ウイルスを2サンプルから検出した。しかし、次世代シーケンサーを用いた高感度な方法でも、検出されたリード数は約2000万リード中2～26リードであり、ウイルス量は非常に微量であることが予想された。

【長瀬隆英　国立大学法人東京大学】
NSAIDs不耐症の一型であるアスピリン喘息（NSAIDs過敏喘息）は、発症頻度や緊急性・重篤性において極めて重大な疾患であり社会的にも注目されている。気管支喘息は極めて多数の因子から病像が形成されており、その発症機序については未だ解明されていないことも多い。気管支喘息の病態的・生理学的特徴として、慢性的な気道炎症・気道過敏性・可逆的な気流制限が挙げられる。気道過敏性の機序はこれまで不明の部分が多かったが、喘息特有の気道炎症に起因していることが明らかになってきた。気道炎症の機序は、炎症細胞と気道構成細胞が放出する炎症メディエーター・サイトカインなどの生理活性物質が相互反応を繰り返す炎症カスケードであると考えられている。しかしながら、気管支喘息、特にアスピリン喘息の発症機序については未解明の部分が多い。また近年、喘息における気道リモデリングが注目されており、その進展が重症度や生命予後に関与する可能性も示唆されている。アスピリン喘息についても、鼻茸と同様に、気道リモデリングの進展が病態形成に関わることが考えられる。本研究では、in vitro気道リモデリングの実験系を作成し、アスピリン喘息における気道リモデリング進展機序に関する基礎的研究と病態解明を目指した。