【全体】シングルセルシークエンスを応用して遺伝子発現とTCR配列を同時に解析し、TCR配列から独自のアルゴリズムでTリンパ球が認識する抗原エピトープごとにクラスタリングしたうえで、遺伝子発現データからそのクラスターごとの詳細な表現型を明らかにする新たに開発した次世代の解析方法で前年度2例解析したが、追加でもう1例解析した。抗PD-1抗体著効例2例では腫瘍浸潤Tリンパ球に、PD-1やLAG-3といった所謂「疲弊」マーカーが上昇し、同じ抗原エピトープを認識しているTリンパ球が集簇しているクラスターが存在した。実際にこのクラスターのTリンパ球は実験的にも腫瘍細胞特異的であることネオ抗原を認識することを明らかにした。逆に、抗PD-1抗体無効例1例ではこのようなクラスターはほとんど存在していないかった。このクラスターはCD39といった既知の腫瘍特異的Tリンパ球マーカーの発現は上昇していたが、その特異性は低く、より特異的な今まで報告のない新たなマーカーを同定した。同定した新たな特異的マーカーを大規模に腫瘍組織で染色で解析したところ、Tリンパ球での発現が抗PD-1/PD-L1抗体の感受性に関わることを明らかにした。一方で、集簇していても腫瘍とは無関係の非特異的Tリンパ球も相当割合で腫瘍局所には浸潤していた。同一患者で抗PD-1抗体治療後の腫瘍浸潤Tリンパ球を解析したところ、治療前には存在しない腫瘍特異的Tリンパ球クローンが新たに浸潤・増殖しており、治療によって腫瘍特異的Tリンパ球のダイナミックなクローン変化が起きていることを明らかにした。これらクローンは末梢血ではほとんど存在せず、別の場所から新たに浸潤してきている可能性が考えられた。また、治療前と治療後で有意な相関があるようなクローンについては、腫瘍特異的なものが少なく、かつ末梢血とも相関があり、これらは単純な混入の可能性が考えられた。以上より本研究課題では新たな解析方法の開発、それによる腫瘍特異的Tリンパ球マーカーの同定を達成した。この成果はバイオマーカーへの実用化や新たな治療方法の開発、将来的な細胞療法への展開も期待できる成果である。　　　【代表者：冨樫庸介】前年度の2例にもう1例追加で合計3例のがん患者（2例は抗PD-1抗体著効例、1例は耐性例）の末梢血リンパ球および腫瘍検体から抽出した腫瘍浸潤リンパ球についてシングルセルシークエンスを行い生データを得た。得られたデータについてKOTAI社と共同で、T細胞受容体が認識する抗原エピトープごとの分類ならびに遺伝子発現データから詳細な表現型解析を行い、集簇した腫瘍特異的Tリンパ球のクラスターを同定し、実験的にも特異性とネオ抗原を認識することを証明した。このクラスターは抗PD-1抗体耐性例には存在しなかった。さらに、その特異的な新たなマーカーも同定し、このマーカーについて免疫染色で検討したところ抗PD-1/PD-L1抗体の効果との相関を認め、効果予測バイオマーカーになる可能性を明らかにした。一方で、集簇していても腫瘍とは無関係の非特異的Tリンパ球も相当割合で腫瘍局所には浸潤していた。1例同一患者で抗PD-1抗体治療後の腫瘍浸潤Tリンパ球も解析できた。結果、治療前には存在しない腫瘍特異的Tリンパ球クローンが新たに浸潤・増殖しており、治療によって腫瘍特異的Tリンパ球のダイナミックなクローン変化が起きていることを明らかにした。これらクローンは末梢血ではほとんど存在せず、別の場所から新たに浸潤してきている可能性が考えられた。また、治療前と治療後で有意な相関があるようなクローンについては、腫瘍特異的なものが少なく、かつ末梢血とも相関があり、これらは単純な混入の可能性が考えられた。【分担者：山下和男】シングセルシークエンスから得られた生データについてバイオインフォマティクスのパイプラインに乗せて解析を行った。さらに独自の解析技術も用いて細胞集団のクラスタリングを行いT細胞受容体が認識する抗原エピトープごとの分類ならびに遺伝子発現データから詳細な表現型解析を行い、腫瘍特異的Tリンパ球の集簇したクラスター、並びにその特異的な新しいマーカーを同定した。また公開されているTCRデータベースについて、HLAがマッチしたTCRデータと比較したところ、腫瘍特異的Tリンパ球の認識抗原エピトープがこれらデータベースとはほとんど一致せず、患者個々に特異的なもの、即ちネオ抗原特異的なものの可能性が考えられた。