標的遺伝子の破壊（ノックアウト(KO)）は、CRISPR-Cas9の急速な普及によって様々な生物種において実施可能となり、既にリソース作製の基盤技術となっている。一方、標的遺伝子座へ自在に外来遺伝子をノックインした個体を作製する技術は、多様なリソース作製においては必須であるものの、ゲノム編集と相同組換え(HR)を利用した方法では効率などの点で十分ではない状況にある。そのため、独自の技術を利用したノックイン(KI)効率の向上とモザイク性の低減、安全な技術の開発と適用が急務である。本課題では、広島大学の開発したマイクロホモロジー媒介性末端結合(MMEJ)を利用した遺伝子KI法（PITCh法）と、大阪大学が開発した一本鎖DNAを‘のり’として用いた遺伝子KI法（2H2OP法）を基盤として、外来遺伝子を挿入するKI法の最適化を行い、NBRPにおいて必要とされる遺伝子KI系統の効率的な作出システムを開発することを目的とした。代表機関の広島大学が大阪大学および山梨大学と連携して、上記の新規の遺伝子KI法を用いてラット、ネッタイツメガエル、ゼブラフィッシュでの標的遺伝子座への遺伝子KIをそれぞれのNBRP中核機関と連携して実施し、高効率でのKIおよびモザイク性の低減、オフターゲットを低減する方法の開発検討を行った。ネッタイツメガエル：リコンビナントCas9タンパク質を用いたPITCh法の検討を行った。KI胚のセレクションを簡便にするため、眼で赤色蛍光タンパク質が発現するマーカーを含むトラップ型ドナーベクターを開発した。ヒト疾患関連遺伝子 cDNAをツメガエルのオルソログ領域のイントロンにKIし、ファウンダー(F0)胚をレポーター活性でセレクションした。得られたレポーター陽性胚をジェノタイピング解析した結果、標的領域へのMMEJを介したKIが確認された。F0胚においてヒト疾患遺伝子cDNA由来のmRNAがRT-PCR法により検出されたことから、このKI法がネッタイツメガエルにとって有用であることが示された。ラット： 2H2OP法およびPITCh法の最適化、および最適化KI法によるヒト疾患モデルとしてのKIラットの作製を行った。分担機関が開発した2H2OP法は、ベクターに相同配列の付加が不要で、大きなサイズのBACベクター等のKIが可能である一方で、つなぎ目の正確性やモザイク頻度、オフターゲットの影響などについては、不明な点が多い。本研究では、①2H2OP法およびPITCh法によるKI技術の最適化とオフターゲット解析、②リコンビナントCas9タンパク質の検討、③ヒト疾患モデルとして使用可能な遺伝子改変ラットの作製を試みた。ゼブラフィッシュ：ヒートショックタンパク質プロモーター領域（hsp）と緑色蛍光タンパク質（eGFP）遺伝子を接続したレポーター遺伝子（hsp-eGFP）を標的遺伝子の開始コドン付近に挿入する新しい解析法を開発した。pax2aは、中脳後脳境界部（MHB）に発現する転写因子であり、そのKOは、MHBの欠損を誘導する。我々は、レポーター遺伝子をpax2a部位に挿入したヘテロ接合体において、eGFPがMHBで観察されることおよびHMBが正常に形成されることを見出した（標的遺伝子の動態解析が可能と考えられた）。一方、そのホモ接合体は、MHBの欠損が認められたことから、KOに依存した機能解析を遂行できると考えられた。さらに、上記のレポーター遺伝子は、非相同末端結合（NHEJ）及びMMEJで標的ゲノム部位に挿入できることを明らかにした。